一種改良的大鼠腦脊液抽取方法

段正昊，楊童雅，呂捷，金宏杰，李金科，朱嘯禹，姜雨杉，張旭

（中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院解剖學教研室，沈陽 110122）

腦脊液是由腦室中脈絡膜產生的一種無色澄清透明的液體，分布于各個腦室以及蛛網膜下腔中［1］。腦脊液成分和性狀的改變，可以反映中樞神經系統(tǒng)的病變情況和腦組織代謝功能異常。因此，腦脊液被廣泛應用于生物化學、藥理學、神經解剖學等研究領域中。動物實驗中，大鼠是常用的實驗動物之一。相關文獻［2］報道，體質量為300 g左右的大鼠其腦脊液總體積大約為580 μL，可以抽取的腦脊液體積所占比重更少。且大鼠腦室內血管豐富，管腔狹小，這極大地增加了抽取腦脊液的難度［3］。因此，腦脊液抽取的成功率過低是很多初次抽取大鼠腦脊液的科研工作者面臨的首要問題。本文介紹了一種操作簡單且適用于初學者的腦脊液抽取方法，為相關科學研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

體質量270～300 g的雄性SD大鼠（購自遼寧長生生物技術有限公司）45只，75%乙醇，1 mL注射器，大鼠腦立體定位儀，眼科剪，鑷子，止血鉗，手術縫合線。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組：將45只大鼠隨機分為3組，每組15只，分別采用直接穿刺小腦延髓池法、經枕骨大孔穿刺法、經皮穿刺小腦延髓池法抽取腦脊液。

1.2.2 大鼠腦脊液的投抽取：大鼠用10%的水合氯醛（0.35 mL/100 g）進行麻醉，待大鼠四肢肌張力消失，或對疼痛刺激無明顯反應時，剪毛，消毒。大鼠腦脊液抽取完成后，縫合肌肉和皮膚，正常飼養(yǎng)，觀察術后存活情況。

1.2.2.1 直接穿刺小腦延髓池法 將大鼠固定在大鼠立體定位儀上，用眼科剪在大鼠兩耳之間做1.5～2.0 cm水平切口，然后在切口正中處，向尾側做2.0～2.5 cm垂直切口，使其呈T字型（圖1）。用鑷子撕開頸菱形肌后，暴露深層的夾肌，用眼科剪鈍性剝離夾肌。剝離完成后，用眼科剪剪斷夾肌肌腱的內側二分之一（圖2）。操作者用止血鉗夾住夾肌斷端后，松開止血鉗，止血鉗在自身重力作用下即可拉開肌肉，充分暴露操作視野。隨后操作者用1 mL注射器在正中線枕骨棘下約3 mm處開始，向下逐漸移動針頭，可找到一處軟組織區(qū)域（圖3），則此時針頭已經觸及寰枕筋膜。調整針頭使坡面向上后，適當用力，有落空感后立即停止進針，緩慢抽取腦脊液，當達到100 μL左右立刻停止，快速抽出針頭，將腦脊液移入1.5 mL EP管中，離心后放入-80℃冰箱里保存。

1.2.2.2 經枕骨大孔穿刺法 大鼠麻醉完成后，利用腦立體定位儀固定大鼠頭部，使身體與頸部呈135°，然后參照曹遠東等［4］的方法進行操作。在頭頸部正中線處切開皮膚，鈍性剝離背部肌肉后，暴露寰枕筋膜，在直視條件下從后外側向小腦延髓池進針。待針頭完全進入后，緩慢抽取腦脊液約100 μL。抽取完成后樣品離心，放入-80 ℃冰箱保存。

圖2 剪斷夾肌肌腱

圖3 進針手法

1.2.2.3 經皮穿刺小腦延髓池法［5］大鼠麻醉完成后，提起大鼠頭部，使頸部與身體呈135°。然后在枕骨棘下緣約0.5 cm處的肌肉間隙進針，進針方向應該與大鼠身體平行，待有落空感后，緩慢回抽。取得樣品后，離心，放入-80 ℃冰箱中保存。

1.3 判斷標準

將收集到的腦脊液在20 min內，在室溫條件下5 000 r/min離心5 min［6］，如果有血細胞沉淀，則為血性腦脊液。未收集到腦脊液或者收集到血性腦脊液，均被判定為實驗失敗。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計各組腦脊液抽取成功的例數(shù)，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 直接穿刺小腦延髓池法

15只大鼠中，從14只大鼠獲得100 μL以上澄清透明的腦脊液，腦脊液抽取成功率為93.33%；剩余1只為血性腦脊液，離心后澄清透明。大鼠術后存活均在1周以上。

2.2 經枕骨大孔穿刺法

15只大鼠中，從3只大鼠獲得澄清透明的腦脊液，且在100 μL以上，腦脊液抽取成功率為20.00%；8只因腦脊液外流而未獲得腦脊液，4只獲得血性腦脊液，離心后上清液過少。大鼠術后1周內死亡2只，其余可正常存活。

2.3 經皮穿刺小腦延髓池法

15只大鼠中，僅從2只大鼠獲得澄清透明的腦脊液，其中1只不足100 μL，腦脊液抽取成功率為13.33%；10只未獲得腦脊液，3只獲得血性腦脊液，離心后澄清透明。大鼠術后1周內死亡5只，其余均可正常存活。

2.4 腦脊液抽取成功率的比較

直接穿刺小腦延髓池法腦脊液抽取成功率明顯高于經枕骨大孔穿刺法和經皮穿刺小腦延髓池法（P＜ 0.01）；經枕骨大孔穿刺法與經皮穿刺小腦延髓池法比較，腦脊液抽取成功率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

3 討論

直接穿刺小腦延髓池法是在經枕骨大孔穿刺法和經皮穿刺小腦延髓池法的基礎上，進行了適當?shù)母牧?。其?yōu)勢如下：（1）T字形切口使手術視野和操作空間較大，易于操作者后續(xù)操作。（2）肌肉沿肌腱部分剪斷，使其易于分離，手術操作可由一人完成。而且出血量較少，手術時視野清晰。（3）頸背部肌肉被剝離，使得進針深度不易被肌肉厚度干擾，針頭刺破寰枕筋膜時落空感明顯，易于掌控。（4）若第一次抽取失敗，由于豎脊肌的封閉阻擋作用，可以使腦脊液不外流，也可以阻止外部血液污染，操作者可以調整針頭方向繼續(xù)穿刺。（5）大鼠術后存活率較高。

經皮穿刺小腦延髓池法是在非直視條件下進行操作，需要操作者對大鼠頸部解剖結構有詳細的了解，且對進針位置和進針角度有非常高的要求。另外，小腦延髓池附近血管豐富，空間狹小，進針和抽取的時候需要用力均勻，否則很容易穿刺過深而導致出血，造成腦脊液抽取失敗。因此，本方法雖然可以縮短操作時間，但卻需要操作者有非常豐富的相關經驗，初學者掌握較為困難。

經枕骨大孔穿刺法雖然可以在直視條件下進行穿刺，但在剝離肌肉過程中，很容易損傷血管造成大量出血，或者損傷寰枕筋膜導致腦脊液大量外流，進而導致腦脊液抽取失敗。

綜上所述，直接穿刺小腦延髓池抽取腦脊液具有成功率高、操作簡單、動物術后存活較好等優(yōu)點，且所有手術操作均在直視條件下進行，適用于無操作經驗的初學者。