水通道蛋白基因在子宮腺肌病患者子宮內膜中的表達及其意義

賈利平，王炳淑， 劉玉珠， 周小飛，王發(fā)輝

子宮腺肌病(adenomyosis，ADS)是一種病理狀態(tài)，其特征是子宮內膜組織存在異常組織如上皮細胞和基質細胞[1-3]。根據術中和組織病理學發(fā)現，ADS可歸為4種不同的類型，即彌漫性、硬化性、結節(jié)性和囊性。大約2/3的ADS女性患有月經過多、痛經和子宮增大的癥狀，在低生育力的女性中占有很高比例[4-5]。但是，ADS的病因和發(fā)病機制仍然知之甚少。子宮腺肌病是一種雌激素依賴性炎性反應疾病。除了激素調節(jié)之外，還報道了許多其他因素，包括炎性細胞因子聚集、神經支配重塑、血管生成增加。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類存在于細胞膜的小分子蛋白，研究表明水通道蛋白家族有廣泛的功能：促進水分子的快速被動運輸；調節(jié)細胞內外滲透壓的平衡；促進細胞遷徙；調節(jié)脂肪代謝；神經信號傳導等[6-8]。AQP不僅在組織水轉運中起到重要作用，也參與了細胞增殖、凋亡、遷移、吞噬和神經信號傳導等過程。研究證實AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宮內膜異位癥中的在位內膜和異位內膜中都有表達[9]。同時研究發(fā)現，在子宮內膜異位癥中AQP1主要表達于在位內膜和異位內膜的微血管和小血管上，而AQP2、AQP5、AQP8主要表達于在位內膜和異位內膜的腺上皮和腔上皮細胞上。本研究擬探討AQP1、AQP2、AQP5與AQP8在子宮腺肌病患者子宮內膜中的表達及其意義，為子宮腺肌病的治療提供理論依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年4月海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦科收治子宮腺肌病患者104例作為ADS組， 78例患有肌瘤或宮頸上皮內瘤變Ⅲ度的婦女為對照組。ADS組年齡27～47(37.6±9.3)歲，孕產史G1P1；對照組年齡27～47(37.1±9.1)歲，孕產史G1P1。所有研究對象在生育年齡(25～46歲)進行子宮切除術，獲取其子宮內膜。研究對象在手術前至少3個月未接受激素治療，且無惡性腫瘤或自身免疫性疾病史。獲取子宮腺肌病患者及對照組子宮內膜后，將組織立刻置于-70℃冰箱保存，用于后續(xù)相應指標的檢測。本研究經醫(yī)院倫理審查委員會批準，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標與方法

1.2.1 AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA在子宮內膜組織表達的測定：使用InvitrogenTMTRIzolTM試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司生產)根據說明從子宮內膜組織中提取總RNA。RNA量通過Nano Drop ND-2000分光光度計(光密度260 nm，美國Nano Drop公司生產)測量，并使用標準變性瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性。用PrimeScriptTMRT試劑盒(日本Takara公司生產)合成cDNA，并使用SYRT PremixEx TaqTM試劑盒(日本Takara公司生產)在Roche LightCycler 480(瑞士Roche公司生產)中進行RT-PCR。為檢測子宮內膜AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表達水平，本研究使用miRNeasyTMMini試劑盒(德國Qiagen公司生產)根據說明提取總RNA(包括microRNA)。使用miRCURY LNATMUniversal cDNA Synthesis試劑盒Ⅱ(丹麥Exiqon A/S公司生產)合成cDNA，并使用miRCURY LNATMExiLENTSYBR-Green Master Mix(丹麥Exiqon A/S公司生產)進行RT-PCR。AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表達水平分別歸一化為U6表達水平。使用2-ΔΔCt方法計算相對表達水平。AQP1引物：5'-GCTGGTTTTCTTTGCTAGCCC-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，AQP2引物：5'-CCGTACGTATCTTTGCCCGTTAG-3'(正向)和5'-CCGTAGCAGGGTCTCGTACG-3'(反向)，AQP5引物：5'-CCTGGACTTCTTTGCCGTGA-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，AQP8引物：5'-CCGTGATTCTTTGCGGTAGC-3'(正向)和5'-CACCGGCAGGGTCTGTATTC-3'(反向)，U6引物：5'-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3'(正向)和5'-AGGAATCCTTCTGACCCATGC-3'(反向)。

1.2.2 AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在子宮內膜組織表達的測定：使用免疫組織化學方法檢測AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宮內膜組織樣品中的表達。兔抗人AQP1、AQP2、AQP5、AQP8多克隆抗體(1∶800)由美國Cell Signaling Technology公司提供。山羊抗兔二級多克隆抗體(1∶1 000)由Cell Signaling Technology公司提供；DBA試劑盒購自北京中山金橋生物技術有限公司。常規(guī)進行免疫組織化學方法檢測AQP1、AQP2、AQP5、AQP8水平。根據Remmele方法計算免疫反應評分。陽性細胞的百分比評分：無染色評分為(-)，計0分；陽性細胞<10%，計1分；10%～50%，計2分；51%～80%，計3分；>80%，計4分。染色強度評分：陰性計0分，低強度陽性染色計1分，中等強度陽性染色計2分，強陽性染色計3分。 染色強度分數加上陽性細胞分數為總分， 0分為陰性染色(-)，2～5分為陽性染色(+)，6分及以上為強陽性(++)。免疫反應評分由2位病理科醫(yī)師獨立完成。

2 結 果

2.1 2組子宮內膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表達水平比較 ADS組中在位子宮內膜組織AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表達水平高于對照組正常子宮內膜(P<0.01)，見表1。

2.2 2組子宮內膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達比較 ADS組中在位子宮內膜組織AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平高于對照組正常子宮內膜(P<0.01)，見表2。

2.3 2組子宮內膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 蛋白表達陽性率比較 ADS組中在位子宮內膜組織AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 蛋白表達陽性率高于對照組正常子宮內膜(P<0.01)，見表3、圖1(見封3)。

表3 2組子宮內膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、 AQP8 蛋白表達陽性率比較 [例(%)]

2.4 2組AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在不同月經周期中的表達水平比較 對照組分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平高于增殖期(P<0.01)；ADS組增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；ADS組增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平均明顯高于對照組增殖期、分泌期相應蛋白表達水平(P<0.05)，見表4。

3 討 論

子宮腺肌病是指子宮內膜腺體和間質在子宮肌層彌漫性或局限性生長，致子宮肌層細胞增生肥大。它是一種婦科常見疾病，好發(fā)于30～50歲育齡婦女，發(fā)病率在不同人群有一定差異，不同流行病學研究統(tǒng)計出的患病率為8%～62%[10]。主要臨床表現有不同程度的繼發(fā)性進行性痛經和異常子宮出血，可能導致不孕和早期流產等，嚴重影響女性的身心健康和生活質量。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，超聲和磁共振檢查子宮內膜腺肌病的敏感度和特異度均有提高，但目前仍缺乏子宮腺肌病早期診斷的有效方法[11]。近年來，許多學者對該病的發(fā)病機制進行了深入研究，但子宮腺肌病的病因及發(fā)病機制仍不清楚。

表1 2組子宮內膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA表達水平比較

表2 2組子宮內膜組織中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達評分比較分)

表4 2組AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白在不同月經周期中的表達水平比較分)

研究表明AQP蛋白家族可能參與ADS的病理過程。AQP蛋白是神經營養(yǎng)因子，它具有2種受體，高親和力酪氨酸激酶受體(TRK)A和低親和力p75神經營養(yǎng)素受體(p75NTR)。作為一種多功能神經免疫調節(jié)劑，AQP蛋白在疼痛、神經可塑性、免疫細胞聚集中有重要調節(jié)作用[12]。在ADS中，AQP蛋白可誘導肥大細胞脫顆粒炎性因子的釋放，進而導致疼痛。研究表明AQP蛋白在子宮內膜異位癥和ADS中異常表達，AQP蛋白參與神經支配和疼痛發(fā)生過程。子宮內膜基質細胞可分泌AQP蛋白，并且AQP蛋白通過p75NTR結合發(fā)揮其對子宮內膜基質細胞的作用。P75NTR屬于TNF/FasCD40受體超家族，可通過NF-κB和神經酰胺信號轉導途徑與其他神經營養(yǎng)因子及其受體結合，影響細胞生長和凋亡[13-14]。小鼠動物試驗發(fā)現ADS病灶的胚胎干細胞可以分泌更多的AQP2、AQP5蛋白，其隨著ADS疾病嚴重程度逐漸增加，AQP2、AQP5蛋白水平逐漸升高。作為一種雌激素依賴性疾病，ADS可以通過抑制卵巢功能或雌激素拮抗作用來治療[15-16]。子宮內膜異位癥和正常女性外周血的雌激素水平無顯著差異。然而，在ADS患者中觀察到月經血中雌激素水平最高，而在正常女性中觀察到雌激素水平最低。在ADS或子宮內膜異位癥病變中發(fā)現高水平的芳香酶(雌激素合成的關鍵酶)，表明異位子宮內膜保留其營養(yǎng)功能。局部分泌的雌激素不僅可以支持異位子宮內膜灶的生長和侵襲，還可以促進受雌激素調節(jié)的細胞因子的表達。AQP蛋白受到雌激素的調節(jié)，研究表明卵巢切除的成年雌性小鼠子宮內AQP蛋白明顯低于對照組[17-18]。在雌激素替代后，AQP蛋白和mRNA水平增加至卵巢切除術前的水平。雌激素周期或外源性雌激素可增加倉鼠子宮中AQP蛋白的表達。研究還發(fā)現，17b-雌二醇促進ADS胚胎干細胞分泌AQP蛋白，其水平相應增加。因此，ADS病變中雌激素分泌增加和對雌激素相對高的敏感性可能是AQP蛋白高表達的原因。本研究結果顯示，ADS組中子宮內膜組織AQP1、AQP2、AQP5、AQP8 mRNA及蛋白表達水平高于對照組，這與上述報道相符合，同時提示，子宮腺肌病患者子宮內膜中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表達水平升高，其參與了子宮腺肌病病理過程。本研究同時發(fā)現，對照組分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平高于增殖期(P<0.01)，ADS組增殖期、分泌期AQP1、AQP2、AQP5、AQP8蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)。這說明AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宮腺肌病患者子宮內膜表達失去月經周期性，這可能是導致子宮腺肌病的原因。

綜上所述，子宮腺肌病患者子宮內膜中AQP1、AQP2、AQP5、AQP8表達水平升高，其參與了子宮腺肌病病理過程；AQP1、AQP2、AQP5、AQP8在子宮腺肌病患者子宮內膜表達失去月經周期性，這可能是子宮腺肌病的原因之一。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

賈利平：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫及修改；王炳淑：質量控制、免疫檢測；劉玉珠：課題指導；周小飛、王發(fā)輝：病例收集