基于多色探針熔解曲線分析技術(shù)的華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性快速檢測方法

黃秋英，夏眾敏，洪國粦，李慶閣

(1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子診斷教育部工程中心，福建 廈門 361102；2.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 廈門 361003)

華法林是一種香豆素類口服抗凝藥，通過抑制維生素K及其2，3-環(huán)氧化物(即維生素K環(huán)氧化物)的相互轉(zhuǎn)化而發(fā)揮抗凝作用.由于療效確切且價格低廉，華法林是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的口服抗凝藥，主要用于預(yù)防和治療靜脈血栓、心肌梗塞、缺血性休克、肺栓塞等多種血栓性疾病，以及用于心臟人工瓣膜置換術(shù)、人工血管移植術(shù)等.華法林的治療窗口較窄(劑量不足有血栓風(fēng)險，過量服用會出現(xiàn)致命性出血)，個體間劑量差異大(達(dá)到適宜抗凝效果的個體間劑量差異可達(dá)10～20倍)且受藥物或食物影響較大，其劑量需求同時受遺傳因素和非遺傳因素的影響.近年來，國內(nèi)外多項研究顯示遺傳因素是造成個體間華法林維持劑量差異的主要原因之一，這些遺傳因素包括CYP2C9、VKORC1、CYP4F2等約30個基因上的多態(tài)性位點(diǎn)[1].

2017年臨床藥物基因組學(xué)實(shí)施聯(lián)盟(CPIC)發(fā)布的遺傳藥理學(xué)指導(dǎo)華法林使用劑量指南[2]中，推薦了目前科學(xué)證據(jù)最強(qiáng)的3個基因用于指導(dǎo)華法林劑量，即CYP2C9、VKORC1和CYP4F2.CYP2C9基因編碼華法林在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，該酶可將華法林代謝為無活性成分.人CYP2C9基因的遺傳多態(tài)性，如中國人群常見的多態(tài)性CYP2C9*3(c.1075A>C，rs1057910)[2-4]、CYP2C9IVS3-65G>C(rs9332127)[5]等，會導(dǎo)致編碼的CYP2C9蛋白活性降低，從而導(dǎo)致患者對華法林的代謝及清除能力降低，臨床表現(xiàn)出對華法林敏感，需要減少給藥劑量以減少不良反應(yīng)的發(fā)生.VKORC1基因編碼維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體(VKORC)的一個亞基，其基因多態(tài)性也會導(dǎo)致VKORC的酶活性改變，從而影響華法林的抗凝效果.其中，VKORC1c.-1639G>A(rs9923231)可導(dǎo)致基因啟動子活性差異，攜帶有等位基因A的患者相比GG純合子患者需要的華法林劑量更少[6-8].CYP4F2是CYP超家族成員之一，主要存在于肝臟和腎臟，為維生素K的單氧酶，近年來的研究發(fā)現(xiàn)CYP4F2*3(c.1297G>A，rs2108622)多態(tài)性能影響1%～2%的華法林個體差異代謝，其中AA純合子患者需要提高華法林劑量方能達(dá)到相同的抗凝效果[9-11].

目前檢測華法林個體化劑量相關(guān)多態(tài)性的方法有多種，主要包括限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性分析(RFLP)[1,12]、基因芯片[13]、等位基因特異性PCR[14]、變性高效液相色譜法(DHPLC)[15]、LNA-taqman探針實(shí)時熒光PCR[16]、高分辨熔解曲線分析(HRM)[17]、焦磷酸測序[18]、Sanger測序等，但這些方法多數(shù)存在操作繁瑣、耗時、需要昂貴儀器、需要PCR后處理以及單個PCR反應(yīng)無法同時檢測多個多態(tài)性位點(diǎn)等缺點(diǎn)，大多數(shù)并不適合用于臨床檢測.

多色探針熔解曲線分析(multicolor melting curve analysis，MMCA)技術(shù)利用末端雙標(biāo)記的自淬滅熒光探針與靶序列雜交，形成的雙鏈雜交體穩(wěn)定性存在差異從而造成熔點(diǎn)的差異，以此來區(qū)分不同的靶基因或突變，在單個PCR反應(yīng)中可以實(shí)現(xiàn)多種靶序列的檢測和基因分型[19].目前，該技術(shù)已應(yīng)用于多種遺傳性疾病相關(guān)基因突變的檢測[20-22].本研究擬利用MMCA技術(shù)在單個PCR反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)對3個華法林個體化用藥相關(guān)基因(CYP2C9、VKORC1和CYP4F2)上4個多態(tài)性位點(diǎn)(rs1057910、rs9332127、rs9923231和rs2108622)的同時檢測和基因分型.

1 材料與方法

1.1 樣本采集和DNA提取

于2016年12月3日廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞應(yīng)激國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放日活動中，用唾液收集器(廈門致善生物科技有限公司)采集廈門地區(qū)隨機(jī)人群(主要是中小學(xué)生)的唾液樣本218份，所有樣本的采集均獲得采集對象及其監(jiān)護(hù)人知情同意.唾液樣本使用廈門致善生物科技有限公司Lab-Aid 820全自動核酸提取儀及配套的核酸提取試劑盒進(jìn)行核酸提取.提取后的基因組DNA使用ND-1000全波長紫外-可見光掃描分光光度計(NanoDrop，美國)對其提取質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測，并將DNA的終質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)為10 ng/μL，直接使用或置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

以4個多態(tài)性位點(diǎn)的野生型基因組DNA為模板，通過直接擴(kuò)增法構(gòu)建野生型序列，采用重疊延伸法構(gòu)建突變型序列，再采用TA克隆法將各序列連接至PMD 18-T載體(TaKaRa，大連)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)，挑取陽性克隆;經(jīng)雙向測序鑒定正確后，提取純化質(zhì)粒DNA并通過ND-1000全波長紫外-可見光掃描分光光度計進(jìn)行定量;隨后分別制備成不同濃度梯度的待檢基因的不同基因型(即野生型、雜合突變型和純合突變型)質(zhì)粒DNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.3 引物和探針設(shè)計

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得CYP2C9、VKORC1和CYP4F2的全基因序列，找到rs1057910、rs9332127、rs9923231和rs2108622多態(tài)性所在位置，針對每個多態(tài)性位點(diǎn)采用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0、TmUtility v1.3軟件先設(shè)計4條自淬滅探針，再圍繞探針分別設(shè)計相應(yīng)的擴(kuò)增引物對.將設(shè)計好的引物和探針通過BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對，保證其擴(kuò)增和檢測的特異性.所有的引物和探針均由上海生物工程有限公司合成，相應(yīng)序列見表1.

1.4 MMCA體系的建立

經(jīng)過優(yōu)化和調(diào)整建立MMCA體系，其具體組分(終濃度)為：1×PCR緩沖液，3 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1 UTaqHS (TaKaRa，大連)，F(xiàn)1、F2和F4各0.06 μmol/L，R1、R2和R4各0.6 μmol/L，1 μmol/L F3,0.1 μmol/L R3，P1和P4各0.2 μmol/L，0.22 μmol/L P2,0.12 μmol/L P3，5 μL DNA模板，用無菌水補(bǔ)齊至總體積25 μL.

PCR和熔解曲線分析均在Bio-Rad CFX96 實(shí)時熒光定量PCR 儀 (Bio-Rad,美國)上進(jìn)行.PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，65～56 ℃(每個循環(huán)下降1 ℃)退火15 s，76 ℃延伸20 s，10個循環(huán)；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，76 ℃延伸20 s，50個循環(huán)，在退火階段采集相應(yīng)檢測通道的熒光信號.反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，程序?yàn)椋?5 ℃變性1 min，35 ℃保溫5 min，隨后按0.5 ℃/5 s的升溫速率從40 ℃遞增至85 ℃，且在此階段采集探針?biāo)鶎?yīng)通道FAM、HEX、CY5、ROX的熒光信號.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用與儀器配套的Bio-Rad CFX Manager 3.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析.

1.5 MMCA體系的評價

利用各多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，由2名操作員分別在2個不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行連續(xù)5次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)中每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，以對MMCA體系的重復(fù)性和再現(xiàn)性進(jìn)行評價.每次實(shí)驗(yàn)均統(tǒng)計各多態(tài)性位點(diǎn)野生型和突變型的Tm值，并計算野生型與突變型的Tm差值(ΔTm).

表1 引物和探針序列

注：下劃線標(biāo)記位置為基因多態(tài)性位點(diǎn).

為考察MMCA體系的檢測靈敏度，用建立好的MMCA體系檢測10倍梯度稀釋的已知基因型的人基因組DNA模板(rs9923231: AA; rs2108622: GG; rs1057910: AA; rs9332127: GG)，每個梯度加入的模板量依次為50，5，0.5，0.05，0.005 ng.根據(jù)0.01 ng人基因組DNA相當(dāng)于3個拷貝，將體系中的初始模板量轉(zhuǎn)換成人基因組DNA的拷貝數(shù).為了進(jìn)一步驗(yàn)證試劑盒的檢測靈敏度，在梯度稀釋實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，再對初步確定檢測限濃度的人基因組DNA樣本進(jìn)行20管平行檢測實(shí)驗(yàn).

1.6 隨機(jī)人群樣本檢測及驗(yàn)證

用所建立的MMCA體系分批次對218份未知人基因組DNA樣品進(jìn)行4個基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測和基因分型，每次實(shí)驗(yàn)均以一份由各多態(tài)性位點(diǎn)(rs9923231: AA; rs2108622: GG; rs1057910: AA; rs9332127: GG)相應(yīng)的質(zhì)粒等比例混合得到的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，以無菌水替代DNA模板為陰性對照(NTC).檢測完成后由Bio-Rad CFX Manager 3.0軟件自動獲取各通道信號，判讀樣本各位點(diǎn)基因型，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析.同時根據(jù)基因分型結(jié)果選擇各多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型的共40份樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序，以驗(yàn)證MMCA體系檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性.

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過χ2檢驗(yàn)判斷所檢測的rs1057910、rs9332127、rs9923231和rs2108622多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，p<0.05表示有顯著差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 MMCA體系的設(shè)計及基因分型結(jié)果

用于華法林相關(guān)基因多態(tài)性檢測的MMCA體系設(shè)計如圖1所示.整個MMCA體系是一個單管四重四色PCR體系，針對4個待檢測的基因多態(tài)性位點(diǎn)分別設(shè)計1對引物和1條覆蓋基因多態(tài)性位點(diǎn)的自淬滅熒光探針，其中每個多態(tài)性位點(diǎn)的檢測熒光探針均標(biāo)記不同熒光基團(tuán)，分別對應(yīng)實(shí)時熒光定量PCR儀中的不同檢測通道FAM、HEX、CY5、ROX.MMCA體系檢測流程包括3個步驟(圖1(a))：首先將各位點(diǎn)的引物和探針均加入PCR反應(yīng)管，進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量可與相應(yīng)熒光探針互補(bǔ)的單鏈產(chǎn)物，隨后進(jìn)行低溫到高溫的熔解曲線分析，采集各通道在整個熔解曲線分析過程的熒光強(qiáng)度(F)；最后，利用實(shí)時熒光定量PCR儀配套的軟件進(jìn)行結(jié)果分析，獲取各熔解曲線的熔解峰，根據(jù)熔解峰的個數(shù)及Tm值的高低判斷各多態(tài)性位點(diǎn)的基因型.

利用不同基因型的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，建立了4個基因多態(tài)性位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線.如圖1(b)所示:當(dāng)模板為野生型時(黑色實(shí)線)，各基因多態(tài)性位點(diǎn)均只有野生型熔解峰；當(dāng)模板為雜合突變型時(灰色虛線)，各基因多態(tài)性位點(diǎn)均有野生型熔解峰和突變型熔解峰；當(dāng)模板為純合突變型時(黑色虛線)，各均只有突變型熔解峰.因此，利用熔解峰的個數(shù)及Tm值的差異，各多態(tài)性位點(diǎn)均可實(shí)現(xiàn)較好的基因分型.

圖1 MMCA體系的基因多態(tài)性檢測流程(a)及各多態(tài)性位點(diǎn)的典型基因分型結(jié)果(b)Fig.1 Flowchart of the MMCA assay for gene polymorphism detection (a), and the typical genotyping results with plasmid of each polymorphism site (b)

2.2 MMCA體系的評價結(jié)果

MMCA體系對各多態(tài)性進(jìn)行區(qū)分是依據(jù)熔解峰Tm值的不同，4個多態(tài)性位點(diǎn)分別分布在4個不同的檢測通道，每個通道可能有2個不同的熔解峰.為避免各熔解峰Tm值的波動范圍太大而導(dǎo)致結(jié)果誤判，對各熔解峰Tm值的重復(fù)性和再現(xiàn)性進(jìn)行考察.結(jié)果表明(表2):各熔解峰Tm值較穩(wěn)定，其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(3SDs)均小于0.9 ℃，相鄰的熔解峰之間沒有交疊，區(qū)分度良好；各多態(tài)性位點(diǎn)的不同等位基因之間Tm值差異波動也很穩(wěn)定，ΔTm均大于3.5 ℃，3SDs均小于0.53 ℃.由以上結(jié)果可見不同操作員在不同實(shí)驗(yàn)室使用不同批次配制的MMCA體系檢測多份質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品時，均能獲得穩(wěn)定的檢測結(jié)果，說明MMCA體系具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性.

表2 各基因多態(tài)性位點(diǎn)的野生型和突變型熔解峰的Tm值

注：Tm為平均值；ΔTm=Tm(野生型)-Tm(突變型).

由于人基因組DNA來源(如血液、唾液、頭發(fā)等)的不同可能造成基因組DNA的提取質(zhì)量及濃度有所不同，而MMCA體系最終檢測的對象是人基因組DNA模板，所以有必要對所建立體系適用的人基因組DNA濃度檢測范圍(即靈敏度)進(jìn)行考察.圖2的結(jié)果表明:MMCA體系可對0.05～50 ng的人基因組DNA模板進(jìn)行檢測，不論模板起始濃度的高低，熔解曲線分析均只產(chǎn)生同一個熔解峰，故不會對標(biāo)本基因型的判斷造成影響;但模板起始濃度會影響熔解峰的高度，在起始模板量為0.005 ng時，有個別通道的熔解峰較低，但對于0.05 ng的模板(相當(dāng)于15個拷貝的人基因組DNA)則各通道均能穩(wěn)定檢測，故將此MMCA體系的最低檢測限初定為0.05 ng的人基因組DNA.

隨后對0.05 ng人基因組DNA的20管平行檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20管在各通道均有穩(wěn)定的熔解峰，檢出率為100%，驗(yàn)證了MMCA體系的最低檢測限為0.05 ng人基因組DNA，說明該體系具有較高的檢測靈敏度.

(a)～(d)分別為FAM、HEX、CY5、ROX通道的擴(kuò)增曲線，(e)～(h)分別為對應(yīng)的熔解曲線分析結(jié)果;各圖中按箭頭指示方向加入的人基因組DNA量依次為50，5，0.5,0.05,0.005 ng，灰色曲線為未加模板的陰性對照.圖2 MMCA體系的檢測靈敏度Fig.2 Detection sensitivity of the MMCA assay

2.3 隨機(jī)人群樣本檢測結(jié)果

利用MMCA體系對218份人基因組DNA樣本的CYP4F2、VKORC1和CYP2C9的4個多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，各多態(tài)性位點(diǎn)檢測結(jié)果參考圖1(b)進(jìn)行判讀.如表3所示，在218份樣本中檢測到CYP4F2rs2108622位點(diǎn)的基因型GG、GA和AA分別為124，82和12例，各占56.9%，37.6%和5.5%；檢測到VKORC1rs9923231位點(diǎn)的基因型GA和AA分別為34和184例，各占15.6%和84.4%，未檢測到野生型純合子GG基因型；檢測到CYP2C9rs9332127位點(diǎn)的基因型GG、GC和CC分別為204，12和2例，各占93.6%，5.5%和0.9%；檢測到CYP2C9rs1057910位點(diǎn)的基因型AA、AC和CC分別為203，14和1例，各占93.1%，6.4%和0.5%.抽取其中40份不同基因型樣本進(jìn)行測序，結(jié)果與MMCA體系基因分型結(jié)果完全一致，說明MMCA體系具有很高的特異性和準(zhǔn)確性.

表3 218例樣本的基因分型結(jié)果及所檢測的各基因多態(tài)性位點(diǎn)的頻率

經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，所選人群的4個多態(tài)性位點(diǎn)rs2108622、rs9923231、rs9332127和rs1057910的等位基因頻率和基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，χ2值分別為0.008，1.139，1.077和1.077，p>0.05.

3 討 論

本研究選用VKORC1、CYP4F2和CYP2C9這3個基因上中國人群出現(xiàn)頻率高的4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)作為檢測對象，利用MMCA技術(shù)在單個四重四色PCR反應(yīng)中成功實(shí)現(xiàn)對4個SNP位點(diǎn)的同時檢測和基因分型.對體系的性能評價結(jié)果表明，該體系有較好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，不同操作人員在不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同批次配制的MMCA體系檢測已知標(biāo)準(zhǔn)品均能獲得穩(wěn)定的結(jié)果，各多態(tài)性位點(diǎn)Tm值的3SDs均小于0.9 ℃；同時該體系可檢測低至0.05 ng的人基因組DNA，具有很高的檢測靈敏度，可以滿足對臨床各種不同來源(唾液、血液、頭發(fā)等)DNA樣本的檢測要求；而對不同基因型質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品和218例隨機(jī)人群基因組DNA樣本的基因分型結(jié)果與部分樣本的測序結(jié)果完全一致，說明MMCA體系檢測具有很高的特異性和準(zhǔn)確性.

通過對218份廈門地區(qū)隨機(jī)人群基因組DNA的4個SNP位點(diǎn)的基因分型，考察了華法林個體化用藥相關(guān)基因的4個SNP位點(diǎn)在廈門地區(qū)的發(fā)生頻率.如表3所示：CYP4F2*3(c.1297G>A, rs2108622)的等位基因G和A的頻率分別為75.7%和24.3%，其中A等位基因攜帶者需要提高華法林用藥劑量；VKORC1c.-1639G>A(rs9923231)的等位基因G和A的頻率分別為92.2%和7.8%，其中A等位基因攜帶者需要減少華法林用藥劑量；CYP2C9*3(c.1075A>C, rs1057910) 的等位基因A和C的頻率分別為96.4%和3.6%，其中C等位基因攜帶者需要減少華法林用藥劑量；CYP2C9IVS3-65G>C (rs9332127)的等位基因G和C的頻率分別為96.4%和3.6%，其中C等位基因攜帶者需要減少華法林用藥劑量.上述4個SNP位點(diǎn)在廈門地區(qū)的發(fā)生頻率均符合已有中國漢族人群的研究結(jié)果[23-24].因此，CYP2C9*3、CYP2C9IVS3-65G>C、VKORC1c.-1639G>A和CYP4F2*3基因多態(tài)性在中國人群具有一定的發(fā)生率，這是影響中國人群華法林個體劑量差異的主要因素.在用藥前進(jìn)行這些基因多態(tài)性檢測，并結(jié)合患者的身高、體質(zhì)量等臨床信息，有助于為患者提供合理的華法林劑量，縮短調(diào)整時間，降低嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生率.

目前國內(nèi)外常用的檢測華法林個體化用藥相關(guān)SNP位點(diǎn)的方法可分為需要PCR后處理的方法(如PCR-RFLP、基因芯片、等位基因特異性PCR、DHPLC、焦磷酸測序、Sanger測序等)和無需PCR后處理的基于實(shí)時熒光定量PCR的方法(如LNA-taqman探針實(shí)時熒光定量PCR、HRM)兩類.其中前者在PCR后需要多步驟操作，容易造成PCR產(chǎn)物污染，耗時長，檢測通量低，臨床適用性差；后者不需要PCR后處理，簡便快速，但單管能同時檢測的位點(diǎn)有限，在一定程度上也限制了臨床上的應(yīng)用.本研究基于MMCA技術(shù)開發(fā)的檢測體系可在單個常規(guī)四重四色PCR反應(yīng)中同時實(shí)現(xiàn)4個SNP位點(diǎn)的基因分型，擴(kuò)增和檢測整個過程均在封閉的管中進(jìn)行，且無需任何PCR后處理，在2.5 h內(nèi)即可完成檢測，操作簡便，檢測通量高，因此與目前方法相比具有多方面的優(yōu)勢，適合推廣用于臨床實(shí)驗(yàn).

4 結(jié) 論

本研究所建立的MMCA體系具有簡便、快速、無需PCR后開蓋處理、檢測通量高等優(yōu)點(diǎn)，在進(jìn)行更深入的臨床性能評價后，有望用于華法林個體化用藥相關(guān)基因CYP2C9、VKORC1和CYP4F2多態(tài)性的臨床分子診斷.