CD133在人結(jié)直腸癌組織中的表達及其與缺氧誘導(dǎo)因子1α和核心蛋白聚糖的相關(guān)性

李怡春，張 敏，楊曉煜，侯玉龍，姬穎華，路 平

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 衛(wèi)輝 453100)

結(jié)腸癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一[1]，SIEGEL等[2]統(tǒng)計結(jié)果顯示，2017年美國約14萬人被診斷為結(jié)腸癌，其中約5 萬人死亡；CHEN等[1]調(diào)查結(jié)果顯示，結(jié)腸癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年升高。隨著外科技術(shù)的不斷進步和各種新型抗癌藥的出現(xiàn)，結(jié)腸癌患者的生存率有了一定的提升[3]，但腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍然是臨床治療的難題。盡管許多靶向藥物已被用于治療結(jié)腸癌，但手術(shù)切除聯(lián)合化學(xué)治療、放射治療仍然是標(biāo)準(zhǔn)的治療手段[4]。大多數(shù)腫瘤起源于腫瘤干細胞，這種細胞具有無限增殖和體內(nèi)外形成腫瘤的能力，但其與腫瘤微血管的關(guān)系目前尚不清楚。有研究報道，在諸多腫瘤中成功分離了腫瘤干細胞，如結(jié)腸癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌等[5]。CD133是戊聚糖跨膜糖蛋白，相對分子質(zhì)量為120 000[6]。雖然CD133 mRNA最初被認為是造血干細胞的標(biāo)志物，但是在正常非淋巴性造血組織中也可能存在CD133 mRNA轉(zhuǎn)錄。CD133在各種實體腫瘤、結(jié)腸癌和膠質(zhì)母細胞瘤中高表達。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是在缺氧狀態(tài)下普遍存在于人體的核轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酸堿度、促進血管生成、誘導(dǎo)自噬、調(diào)控凋亡以及促進間充質(zhì)干細胞自我更新與分化的功能，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義[7-8]；核心蛋白聚糖(decorin，DCN)是富含亮氨酸的蛋白聚糖基因中的一種小分子成員，作為一種核心糖蛋白，是重要的細胞外基質(zhì)成分之一，可以抑制多種腫瘤如腎癌、肝癌和乳腺癌的體外增殖及遷移[9]。CD133、HIF-1α及DCN在腫瘤進程中均有重要作用，然而，它們之間關(guān)聯(lián)性的研究相對較少。本研究旨在檢測CD133在人結(jié)直腸癌組織中的表達，探討CD133與HIF-1α和DCN的相關(guān)性，以及CD133表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年12月至2013年7月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的癌組織及相對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本 34例為研究對象，其中男19例，女15例；年齡26～75(50.23±11.01)歲；高分化腺癌19例，中分化腺癌10例，低分化腺癌5例；TNM分期：Ⅱ期13例，Ⅲ期11例，Ⅳ期10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例?；颊咝g(shù)前均未進行放射治療和化學(xué)治療。本研究經(jīng)患者及家屬知情同意，并獲新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器兔抗人CD133單克隆抗體(ab19898)購自英國Abcam公司，小鼠抗人DCN單克隆抗體(SC-73896)購自美國Santa cruz公司，兔抗人HIF-1α 單克隆抗體(BS3514)購自美國Bioworld公司；GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自基因科技(上海)股份有限公司，枸櫞酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自北京索萊寶科技有限公司； NikonECLIPSE55i型BX51熒光顯微鏡購自日本尼康株式會社，BX51熒光顯微鏡購自日本尼康株式會社。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測癌組織及癌旁組織中CD133、HIF-1α和DCN的表達將結(jié)直腸癌組織及癌旁組織標(biāo)本制作石蠟切片，并在病理切片及相應(yīng)組織蠟塊上進行標(biāo)記。首先，石蠟標(biāo)本切片厚約 3 μm，烤片 60 min，經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，用枸櫞酸鈉緩沖液修復(fù)。體積分數(shù)3%H2O2處理，PBS洗3次，每次5 min；血清封閉30 min，甩去血清，加入稀釋好的一抗4 ℃過夜；加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色；蘇木精復(fù)染，切片脫水，封片，顯微鏡下觀察，每張切片于表達最密集處取3個視野，使用Imagepro-plus軟件對CD133、DCN、HIF-1α的相對表達量進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 CD133、DCN和HIF-1α在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達結(jié)果見圖1～3。CD133在結(jié)直腸癌組織中主要位于細胞膜和細胞質(zhì)，呈黃色顆粒；DCN主要位于細胞外基質(zhì)和纖維組織，呈黃色顆粒；HIF-1α主要位于細胞核和部分細胞質(zhì)，呈黃褐色顆粒。結(jié)直腸癌組織中CD133、HIF-1α和DCN的相對表達量分別為0.123±0.023、0.117±0.036、0.049±0.018，癌旁組織中CD133、HIF-1α、DCN的相對表達量分別為0.026±0.048、0.018±0.035、0.211±0.014。結(jié)直腸癌組織中CD133、HIF-1α的相對表達量高于癌旁組織，結(jié)直腸癌組織中DCN相對表達量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：癌旁組織；B：癌組織。

圖1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中CD133表達(HE染色，×100)

Fig.1 Expression of CD133 in adjacent tissues and colorectal cancer tissues (HE staining，×100)

A：癌旁組織；B：癌組織。

圖2 癌旁組織和結(jié)直腸癌組織中DCN表達(HE染色，×400)

Fig.2 Expression of DCN in adjacent tissues and colorectal cancer tissues (HE staining，×400)

A：癌旁組織 ；B：癌組織。

圖3 癌旁組織和結(jié)直腸癌組織中HIF-1α表達(HE染色，×400)

Fig.3 Expression of HIF-1α in adjacent tissues and colorectal cancer tissues (HE staining，×400)

2.2 結(jié)直腸癌組織中CD133表達與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系結(jié)果見表1。CD133的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分級有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)。

表1 結(jié)直腸癌組織中CD133表達與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

臨床特征nCD133表達量t/FP年齡 ≥ 60歲120.121±0.0220.452>0.05 <60歲220.124±0.027性別 男190.127±0.0270.851>0.05 女150.119±0.013淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有160.108±0.0133.589<0.05 無180.127±0.024病理分級 低50.129±0.025 中100.108±0.0163.589<0.05 高190.136±0.006臨床TNM分期 Ⅱ期130.112±0.019 Ⅲ期110.120±0.0208.203<0.05 IV期100.142±0.020

2.3 人結(jié)直腸癌組織中CD133與HIF-1α、DCN表達的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析顯示，結(jié)直腸癌組織中CD133表達與HIF-1α 表達呈正相關(guān)(P<0.05)，與DCN表達無顯著相關(guān)性(P>0.05 )。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CD133主要表達于結(jié)直腸癌細胞膜表面和細胞質(zhì)內(nèi)，這與文獻[10]報道的CD133主要位于細胞膜表面不同，原因可能為使用了不同類型的抗體，導(dǎo)致結(jié)果具有差異性，需要進一步探討。

CD133蛋白是在人類造血干細胞上發(fā)現(xiàn)的戊跨膜糖蛋白，最初被認定為造血干細胞的特異性標(biāo)志。在目前的研究中，CD133單獨與其他分子作為分選標(biāo)記，分選出陽性亞群細胞的生物學(xué)特性。ZHOU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌HCT116細胞中，CD133+亞群具有克隆形成和腫瘤形成的能力。這些研究提示CD133與結(jié)腸癌HCT116細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

ISHIMOTO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CD133可以作為胃癌預(yù)后評估的指標(biāo)，認為CD133可能是結(jié)直腸癌的重要標(biāo)志物。CD133表達與胃腸道腫瘤患者的臨床病理特征和預(yù)后有明顯關(guān)系，隨著CD133表達的升高，腫瘤的分化程度降低、浸潤程度加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目增多。KOJIMA等[13]采用免疫組織化學(xué)法分析CD133在結(jié)直腸癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21例患者CD133呈過表達，且均為中分化或高分化腺癌。本研究觀察到CD133在結(jié)直腸癌組織中的表達情況與HORST等[14]和KOJIMA等[13]的研究類似，CD133在癌旁組織、腫瘤組織中均有表達，且腫瘤組織的表達明顯高于癌旁組織，CD133 可作為結(jié)直腸癌患者的獨立預(yù)后因子。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌組織中CD133表達，并分析其與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD133表達與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的臨床分期和分化程度有關(guān)，即腫瘤組織中 CD133表達量越高，其發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性就越大，腫瘤的侵襲能力和惡性程度就越高。

D133和HIF-1α在結(jié)直腸組織中的表達具有正相關(guān)性，因此可以證實，缺氧微環(huán)境、腫瘤干細胞在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。HIF-1α是介導(dǎo)細胞低氧反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在多數(shù)癌組織中呈高表達[15-16]。缺氧與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程調(diào)控關(guān)鍵因子來影響腫瘤進展；在結(jié)直腸癌組織中，HIF-1α可以通過激活細胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶、絲裂原活化蛋白激酶等通路來調(diào)節(jié)CD133表達[14]。CD133可通過增加腫瘤細胞的葡萄糖攝取的過程，導(dǎo)致缺氧，從而誘導(dǎo)HIF-1α的產(chǎn)生，刺激腫瘤血管形成，增加其侵襲轉(zhuǎn)移的能力。這些機制在維持腫瘤細胞的能量代謝、血管形成等過程中發(fā)揮重要作用。

馮晨露等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CD133與HIF-1α、CD133與DCN、DCN與HIF-1α有相互調(diào)節(jié)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中CD133表達與HIF-1α表達呈正相關(guān)，與DCN表達無明顯相關(guān)性，考慮主要與下列原因有關(guān)：(1)實驗的樣本量較小；(2)病例來源集中于豫北地區(qū)，存在人群局限性。因此，其相關(guān)性需要進一步擴大樣本量進行驗證。

綜上所述，CD133在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，通過檢測CD133、DCN與HIF-1α的表達可判斷結(jié)直腸癌的惡性程度，CD133可以作為預(yù)后評估的潛在指標(biāo)，并提供治療靶點，但其具體機制有待進一步探討。