BAP1及其對透明細胞腎細胞癌的抑制作用

吳 瑩，李學英，潘有福

(遵義醫(yī)科大學 醫(yī)學遺傳學教研室暨貴州省基因檢測與治療特色重點實驗室，貴州 遵義 563099)

腎癌，也稱腎細胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)，在泌尿系統(tǒng)腫瘤中位居第三[1]，也是全世界10種最常見的癌癥之一[2]，發(fā)病率約占全世界成人惡性腫瘤的3%[3]，且發(fā)病率逐年升高。其中約有80%的腎癌是透明細胞腎細胞癌(Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)[4]。ccRCC主要依靠手術(shù)治療[2]，但由于其早期發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移患者治療依賴于分子靶向治療等，對于轉(zhuǎn)移患者來說面臨著耐藥性制約療效的問題[5-9]，因此，徹底弄清楚透明細胞腎細胞癌發(fā)生發(fā)展的機制，有助于透明細胞腎細胞癌的治療。

BAP1是BRCA1相關(guān)蛋白1(BRCA1-associated protein 1,BAP1)，是一個腫瘤抑制因子，近年來的研究揭示了其與透明細胞腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展存在某種關(guān)系[10-11]。因此，本文針對BAP1在透明細胞腎細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用進行綜述和展望。

1 BAP1的結(jié)構(gòu)

BAP1位于3p21.1，編碼一個由729個氨基酸組成的蛋白質(zhì)BAP1。BAP1由N-泛素羧基水解酶(Ubiquitin C-terminal hydrolases,UCH)結(jié)構(gòu)域(第1-250AA)、HCF-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HCF-1-binding domain,HBM)(第363-366AA)和兩部分核定位信號(Nuclear localisation signal,NLS)(第656-661AA和717-722AA)組成[10,12](見圖1)。

(據(jù)Murali[2013年]修改)。圖1 BAP1蛋白的結(jié)構(gòu)

2 BAP1的生物學功能

BAP1是一個去泛素化酶[13-14]，最初被鑒定為與乳腺癌基因1(Breast cancer gene 1，BRCA1)的RING結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)[15]，它通過去泛素化作用參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、DNA損傷修復等過程，從而發(fā)揮其抑癌作用[10-11](見圖2)。

2.1 去泛素化作用 目前已發(fā)現(xiàn)人類的100多個去泛素化酶。根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)相似性可分為5個亞家族：泛素羧基末端水解酶家族(Ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)、泛素特異性蛋白酶家族(Ubiquitin-specificproteases,USPs)、卵巢腫瘤蛋白酶家族(Ovarian tumour proteases,OTUs)、Josephins家族以及JAB1/MPN/MOV34金屬酶家族(JAMMs)[16-17]。其中UCHs是第一個結(jié)構(gòu)表征明確的去泛素化酶亞家族，BAP1是其主要成員之一[18]。UCHs在多種腫瘤如腎癌、宮頸癌、乳腺癌、葡萄膜黑色素瘤等組織中均存在低表達[19-22]。UCHs通過其去泛素化作用抑制蛋白質(zhì)降解、提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[16]，調(diào)控腫瘤發(fā)生中蛋白質(zhì)的泛素化水平，從而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。BAP1通過使組蛋白H2A(Histone H2A)去泛素化來調(diào)節(jié)細胞周期、細胞分化、細胞膜轉(zhuǎn)運、基因轉(zhuǎn)錄和DNA修復等多種細胞過程[16,23]。BAP1使H2A第119位賴氨酸(H2AK119)去泛素化而降低其泛素水平，宿主細胞因子1(Host cell factor 1,HCF-1)作為支架蛋白，其含有結(jié)合保守的肽序列的Kelch結(jié)構(gòu)域，以及幾種轉(zhuǎn)錄因子共有的HCF-1結(jié)合基序(HBM)，HCF-1通過HBM序列與BAP1結(jié)合并將BAP1募集至E2F應答啟動子，使E2F應答啟動子上H2A第119位賴氨酸泛素化(H2AK119ub1)的水平降低，從而使細胞周期進展到S期(見圖2a)。相反，由于BAP1基因缺失/突變可能影響B(tài)AP1蛋白的去泛素化活性，使E2F應答啟動子上H2AK119ub1的水平增加，使下游基因不能正常表達[24-26]。同時，BAP1基因的缺失降低了G1/S期檢測點的保真度，不能發(fā)揮抑制細胞增殖的作用，促進癌癥發(fā)生[25,27-29]。然而，Jensen等[30-31]發(fā)現(xiàn)BAP1缺失導致G1期停滯，從而干擾細胞周期。Bott等[32-35]發(fā)現(xiàn)BAP1敲低抑制細胞增殖，如在惡性胸膜間皮瘤細胞、乳腺癌細胞、皮膚黑色素瘤細胞、白血病細胞中。BAP1究竟是怎樣通過去泛素化作用發(fā)揮抑癌機理，目前尚無統(tǒng)一定論。目前已發(fā)現(xiàn)的BAP1去泛素化底物有H2A、HCF-1、INO80、KLF5、MCRS1、γ-tubulin以及BAP1自身[31]，但未見更深入的報道。

2.2 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控 BAP1可與多種轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白結(jié)合，以調(diào)控基因表達，目前已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白有HCF-1、額外的性梳狀蛋白ASXL1和ASXL2(Additional sex combs,ASXL1 / 2)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子FoxK1和FoxK2(forkhead transcription factors K1/2)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Ying Yang 1,YY1)、O-連接的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(OGT)以及賴氨酸特異性脫甲基酶KDM1B/LSD2/AOF1[12,36-38]。轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白ASXL1和ASXL2通過其N末端結(jié)構(gòu)域(ASXM)(ASXM結(jié)構(gòu)域是BAP1泛素結(jié)合和泛素化的先決條件)與BAP1的C末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD)相互作用形成PR-DUB(Polycomb repressive deubiquitination)復合物，使H2AK119去泛素化以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及細胞周期進程[30]。BAP1的敲低或同時伴有ASXL1或ASXL2的敲低引起H2A的泛素水平升高，也消除BAP1/ ASXL1/2調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞衰老的能力，導致BAP1酶活性喪失，從而引發(fā)癌癥，這更加確定了BAP1-ASXL1/2復合物對癌癥抑制的作用[24,38-41]。BAP1-HCF1復合物可分別與轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白FoxK1/K2和YY1結(jié)合形成三元復合物以調(diào)控基因表達。FoxK2通過其FHA結(jié)構(gòu)域識別BAP1的Thr(P)-493(蘇氨酸-493磷酸化位點)將BAP1募集到特定的基因組區(qū)域，并通過使H2AK119去泛素化以調(diào)控基因表達[14,42](見圖2b、c)。BAP1通過其卷曲螺旋基序與YY1的鋅指相互作用， BAP1與HCF-1一起被YY1募集到編碼線粒體呼吸鏈組分的COX7C基因的啟動子上，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[43-44](見圖2d)。

2.3 參與表觀遺傳調(diào)控 多梳家族PcG(Polycomb group)是形成多蛋白復合物的蛋白質(zhì)家族，其涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對細胞分化、發(fā)育及自我更新至關(guān)重要。PcG家族的兩個主要成員PRC1和PRC2(Polycomb repressive complex 1/2)分別負責組蛋白泛素化和甲基化。PRC2介導H3K27三甲基化(H3K27me3)，其引發(fā)PRC1向H3K27me3位點募集，其中PRC1通過H2AK119ub1抑制多梳靶基因的表達。在正常條件下，BAP1通過使H2AK119去泛素化以調(diào)控多梳靶基因的表達[27,43](見圖2e)。

BAP1可調(diào)控mRNA和miRNA，miRNA通過RNA干擾的表觀遺傳機制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達，miRNA與靶基因轉(zhuǎn)錄物的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)中的互補序列結(jié)合，導致mRNA降解和/或翻譯受到抑制，從而影響靶基因的表達和功能。miRNA涉及多種細胞生理過程(如增殖、凋亡、分化、運動、侵襲等)的調(diào)控，并在調(diào)節(jié)基因表達中起著核心作用，其異常表達與多種癌癥相關(guān)，每種癌癥都具有獨特的miRNA表達模式，miRNA在癌細胞中過表達或表達降低使其分別作為癌基因或抑癌基因[15,45-46]。

2.4 參與DNA損傷修復 BAP1與腫瘤抑制復合物BRCA1-BARD1(BRCA1 associated RING domain 1,BARD1)相互作用，BRCA1-BARD1腫瘤抑制復合物具有E3泛素連接酶活性。BAP1通過發(fā)揮去泛素化作用， 將BARD1去泛素化，從而抑制BRCA1-BARD1的E3泛素連接酶活性。通過shRNA抑制BAP1的DNA損傷修復并導致Hela細胞對電離輻射敏感，從而導致S期延遲。因此，BRCA1介導的泛素化和BAP1介導的去泛素化可能共同協(xié)調(diào)并參與DNA損傷修復[10,43](見圖2f)。BAP1在DNA損傷后被磷酸化，從而促進其聚集到DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSB)位點以進行H2A去泛素化并調(diào)節(jié)下游DNA雙鏈斷裂信號傳導和修復蛋白質(zhì)的募集，從而促使細胞從DNA損傷中恢復[47](見圖2g)。Yu等[47]通過在雞DT40細胞中敲除BAP1，抑制了BAP1募集到DNA雙鏈斷裂位點，BAP1的缺失會減少同源重組(Homologous recombination,HR)，這是一種無錯的DNA修復機制。在此條件下，細胞可能變得更依賴非同源性末端接合(Nonhomologous end joining,NHEJ)，這是一種易錯的DNA修復機制，導致基因組不穩(wěn)定性突變和染色體畸變的凈累積。而且，由于BAP1缺失，檢查點信號傳導的缺陷可以促進含受損DNA細胞的存活，從而驅(qū)動腫瘤形成[47]。此外，Eletr等[48]發(fā)現(xiàn)BAP1的缺失改變了幾種蛋白質(zhì)的mRNA水平，包括涉及DNA復制和DNA修復的亞型。Ge等[45]通過使用人類DUB RNAi文庫篩選去泛素化酶，發(fā)現(xiàn)BAP1的敲低引起DNA雙鏈斷裂位點處的BRCA1/RAD51形成減少，DNA損傷修復蛋白(DNA damage repair protein 51,RAD51)是DNA損傷修復中的一個重要組成成分，對維持基因穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用，而BRCA1與多種蛋白質(zhì)相互作用參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復等[49]。Chapman等[50-51]發(fā)現(xiàn)BRCA1/RAD51以細胞周期依賴的方式通過HR促進DSB修復，且RAD51-/-小鼠和BRCA1-/-小鼠均不能存活，進一步證明了BAP1的敲低會阻斷DNA損傷修復，使細胞不能執(zhí)行其正常功能，從而導致癌癥發(fā)生[49]。然而，BAP1在DNA損傷修復中的確切機制尚不清楚，但已有的數(shù)據(jù)揭示了BAP1在DNA損傷修復中的重要作用，從而為其發(fā)揮抑癌作用提供了可能的分子基礎。

3 BAP1在透明細胞腎細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用

3.1BAP1突變BAP1是在ccRCC中發(fā)揮重要作用的一個抑癌基因[52-53]。Pea-Llopis等[54]在176個ccRCC病例中檢測出BAP1突變率為14%(24/176)；Guo等[55]對10個ccRCC患者的BAP1進行了全外顯子組測序，同樣檢測出BAP1突變率高于預期；Hakimi等[56]發(fā)現(xiàn)BAP1突變率隨著腫瘤發(fā)展進程而增加，表明BAP1可能參與ccRCC進展。近幾年發(fā)現(xiàn)種系BAP1突變會導致腎癌、葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、胰腺癌、膽管癌等的發(fā)生率升高[10,40-41,43,55,57-59]。Kluzek等(2017年)[60]使用全基因組SNP基因分型法鑒定了83例ccRCC患者的染色體變異，確定了BAP1的腫瘤特異性體細胞突變。

BAP1與其它3個ccRCC相關(guān)抑癌基因VHL、PBRM1和SETD2均位于3號染色體短臂上。ccRCC的發(fā)生發(fā)展與VHL基因突變伴3p缺失有關(guān)[11,61]，其中VHL突變率最高，約70%以上的散發(fā)性ccRCC患者中有VHL突變[4]。其它2個基因的突變率約為40%(PBRM1)、16%(SETD2)[62]。VHL、PBRM1突變率較高，但是VHL、PBRM1單基因敲除小鼠并未產(chǎn)生ccRCC或其它類型腎癌，而VHL-BAP1純合缺失小鼠，顯示出腎癌或癌前病變，小鼠在1個月內(nèi)死亡[52,63]；Gao(2017)等[64-65]發(fā)現(xiàn)與BAP1有關(guān)的VHL-BAP1、PBRM1-BAP1的雙基因敲除小鼠均能產(chǎn)生ccRCC，提示了BAP1可能是比VHL、PBRM1更為重要的腎癌抑制基因。目前可得到的數(shù)據(jù)支持圖3中描述的ccRCC發(fā)展模式[24]。

研究觀察到大部分ccRCC患者中VHL突變是起始事件，隨后3p的缺失使得剩余的VHL、BAP1和PBRM1基因失活。BAP1和PBRM1同時突變的腫瘤頻率低。BAP1突變或PBRM1突變可分別導致腫瘤發(fā)生，PBRM1突變將有助于形成低度惡性的腫瘤，BAP1突變將可能導致更大的侵襲性，形成高度惡性的腫瘤[12,24,65-66]。

(據(jù)Brugarolas[2014年]修改)。圖3 ccRCC的發(fā)展模式

3.2 BAP1的抑癌作用

3.2.1 BAP1通過去泛素化發(fā)揮抑癌作用 雖然BAP1在ccRCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未完全明確，但研究表明，BAP1突變可能影響B(tài)AP1蛋白去泛素酶活性，或?qū)е缕浜硕ㄎ恍蛄械娜笔?，破壞BAP1蛋白的抑癌作用，從而導致腎癌的發(fā)生(李則等2017年)[31,67-68]。

3.2.3 BAP1通過參與表觀遺傳調(diào)控發(fā)揮抑癌作用 當BAP1功能正常時，BAP1有助于使H2AK119去泛素化，從而建立調(diào)節(jié)多梳靶基因表達的H2AK119的泛素化和去泛素化之間的平衡。當BAP1突變時，這種平衡被破壞，導致多梳靶基因調(diào)控功能失調(diào)，從而引發(fā)ccRCC[27,40]。

BAP1同樣也可調(diào)控miRNA的表達，提示miRNA可以作為臨床診斷、治療及預后的重要生物標志物[15,45-46]。Ge等[46]通過對ccRCC患者的腫瘤標本和正常腎組織之間異常表達的miRNA進行分析，鑒定了不同的、具有臨床意義的miRNA表達譜，其中11個miRNA可組成腫瘤特異性miRNA標簽，包括miR-149、miR-29b-2、miR-182、miR-183、miR-21、miR-365-2、miR-671、miR-365-1、miR-10b、miR-139和miR-181a-2，它們可能作為沒有BAP1突變(BAP1+/+)的ccRCC患者的獨立預后因子。此外，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)途徑富集分析顯示了32個miR-29b-2相關(guān)通路、62個miR-182相關(guān)通路和25個miR-671相關(guān)通路，miR-182可能通過調(diào)節(jié)8個靶基因參與ccRCC發(fā)生發(fā)展[45]。但以上結(jié)果仍處于分析預測階段，有待進一步實驗驗證。

3.2.4 BAP1通過參與DNA損傷修復發(fā)揮抑癌作用 BAP1的抑癌機制也與DNA損傷修復和基因組不穩(wěn)定性相關(guān)。Pea-Llopis等[54]發(fā)現(xiàn)，在表達突變型BAP1的兩個ccRCC細胞系(UMRC6和769-P)中使用shRNA敲除BAP1導致暴露于電離輻射后的細胞活力降低。BAP1的缺失會損害細胞有效修復損傷的能力，阻止細胞周期進展，并抑制參與DNA復制和修復途徑的基因的轉(zhuǎn)錄[48]。

基因組學研究表明，BAP1突變呈現(xiàn)特征性的表達譜特征。Kapur等[66]通過TCGA分析了308個ccRCC患者RNA-seq數(shù)據(jù)的基因表達特征，如果問BAP1突變腫瘤是否能與其它腫瘤區(qū)分開來，結(jié)果是：發(fā)現(xiàn)BAP1突變腫瘤(n=20)有3250個基因有顯著表達變化，遠遠多于隨機選擇20個樣本與剩余樣本的比較分析結(jié)果(三次分析分別得到115個、63個、120個顯著差異表達基因)。BAP1突變腫瘤組(3250個基因)和隨機腫瘤組的表達基因數(shù)量差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P≦0.0001)，BAP1突變腫瘤具有特征性基因表達特征。這些分析，也突出了其作為腫瘤預后生物標志物和未來治療靶點的潛力[71]。

3.3 腫瘤逃脫免疫監(jiān)視在BAP1抑癌中的作用 最近的研究表明，BAP1的抑癌機制與腫瘤逃脫免疫監(jiān)視有關(guān)。Wang等[72]通過對中國15例ccRCC患者全外顯子組測序，認為體細胞BAP1突變可能促成ccRCC細胞中程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-Ligand 1,PD-L1)的表達。T細胞膜上的程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)與腫瘤細胞膜上的配體PD-L1結(jié)合后會向T細胞傳遞一種負向調(diào)控信號，降低淋巴結(jié)CD8+ T細胞的增生，讓其無法識別腫瘤細胞，并且誘導T細胞凋亡，抑制T細胞活化和增殖，降低機體免疫力，導致癌細胞迅速增長[73]。

4 展望

ccRCC早期轉(zhuǎn)移患者容易發(fā)生耐藥性且預后差，5年生存率只有10%左右，使得開發(fā)新的ccRCC靶向治療藥物顯得尤為迫切。BAP1作為新發(fā)現(xiàn)的一個重要的腎癌抑制基因已受到廣泛關(guān)注，深入了解BAP1確切的抑癌機制可能為尋找新的ccRCC靶向治療藥物提供方向。

對其它癌癥，BAP1可能通過與相關(guān)蛋白質(zhì)(HCF-1、H2A、YY1、ASXL1/2、FoxK1/K2)相互作用而發(fā)揮抑癌作用。在ccRCC 769-P細胞中已發(fā)現(xiàn)BAP1與HCF-1相互作用抑制細胞增殖，那ccRCC其它細胞系或患者癌腫組織中是否存在與其它癌癥相同的蛋白相互作用和作用機制？以及是否有其它相互作用蛋白參與ccRCC進程？其靶蛋白是什么？目前尚未明確。

新型表觀遺傳學療法有的在臨床試驗中，或有的表觀遺傳系統(tǒng)藥物在臨床使用中，但仍處于初級階段，有望在不久的將來為克服ccRCC患者的治療耐藥性提供解決方案。隨著基因表達譜分析技術(shù)的廣泛應用，探究ccRCC中BAP1調(diào)控的目標mRNA、miRNA，將有可能發(fā)現(xiàn)更多ccRCC治療研究的新型生物標志物。

目前基礎研究表明，BAP1、PBRM1等抑癌基因的突變，與ccRCC病人的腫瘤分級及預后高度相關(guān)。因此，應用組學等先進技術(shù)進一步研究BAP1對ccRCC發(fā)生發(fā)展的抑制作用，將有望為臨床上對腎癌的分型和個性化診斷治療提供有用的基礎資料。