藥物中基因毒性雜質(zhì)分析方法的研究進(jìn)展

王敏

天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 301700

基因毒性雜質(zhì)是在藥物中以痕量水平存在的雜質(zhì)，其能夠與DNA反應(yīng)以誘導(dǎo)DNA損傷，導(dǎo)致基因突變和誘發(fā)癌癥的可能性。與藥物中的其他類(lèi)型雜質(zhì)相比，基因毒性雜質(zhì)極端極性。低暴露水平會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性，對(duì)藥物的安全性構(gòu)成嚴(yán)重威脅。磺酸酯是一類(lèi)潛在的基因毒性雜質(zhì)，通常來(lái)自磺酸或其衍生物，如磺酰氯，磺酸酐和低級(jí)醇溶劑（如甲醇，乙醇，異丙醇等）之間的副反應(yīng)。由于磺酸鹽類(lèi)藥物被廣泛使用，不可避免地在合成中使用低級(jí)醇，使得藥物中磺酸酯的殘留風(fēng)險(xiǎn)更為普遍，這引起了很多關(guān)注。本文將首先闡述與基因毒性雜質(zhì)有關(guān)的重大事件，再進(jìn)一步剖析基因毒性雜質(zhì)的部分檢測(cè)方法及控制策略。最后闡述磺酸酯類(lèi)雜質(zhì)的研究進(jìn)展。

1 三起毒素門(mén)事件給制藥行業(yè)帶來(lái)的警醒和反思

2007年6月6日，歐洲藥品管理局（EMA）發(fā)現(xiàn)，一些批次的抗艾滋病藥物Viracept，奈非那韋甲磺酸鹽含有高劑量的基因毒性雜質(zhì)（genotoxicimpurities，GTI）甲磺酸乙酯（含量超過(guò)1．1×10-3），決定召回羅氏制藥公司生產(chǎn)的奈非那韋甲磺酸鹽。．甲磺酸乙酯是潛在的致癌物質(zhì)，劑量為2．5g/d，患者會(huì)攝取高達(dá)2．75mg的甲磺酸乙酯，這會(huì)嚴(yán)重影響患者的健康[1]。而在2018年7月14日，華海制藥的治療高血壓藥物纈沙坦（valsartan）被發(fā)現(xiàn)含有痕量N，N- 亞硝基二甲胺（NDMA）。并且從歐洲，美國(guó)和中國(guó)市場(chǎng)召回了纈沙坦及其相關(guān)的制劑產(chǎn)品。隨后，在2018年8月20日，在印度Torrent制藥公司生產(chǎn)的纈沙坦片中也發(fā)現(xiàn)了NDMA。這個(gè)公司還心甘情愿的從美國(guó)的市場(chǎng)上大量的召回了一些藥品。毒素門(mén)事件，給眾多的患者的生命健康都帶來(lái)了極大的隱患，不僅如此，還給很多的制藥企業(yè)也帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失，這個(gè)事件也算是對(duì)整個(gè)藥品生產(chǎn)行業(yè)的警示。

2 來(lái)源于反應(yīng)物的基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法

假如物質(zhì)中能引起基因毒性和致癌性的結(jié)構(gòu)部分在化學(xué)合成中是不可避免的，那么應(yīng)該采用技術(shù)手段盡可能的減少基因毒性雜質(zhì)在產(chǎn)品中的含量，使其符合安全需求或使其降低到一個(gè)合理的范圍內(nèi)。對(duì)于活性反應(yīng)物、中間體及其他化合物的化學(xué)穩(wěn)定性均應(yīng)評(píng)估，并有合理的檢測(cè)方法去分析這些雜質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行量化[2]。

2.1 分析方法和難點(diǎn)

揮發(fā)性的烷基鹵化物包括的種類(lèi)很多，就像鹵代丙烷、鹵代甲烷、鹵代乙烷。要進(jìn)行對(duì)于這些鹵化物的檢測(cè)，一般選用的檢測(cè)方法就是液相色譜法。而且為了能夠更好的將分析物進(jìn)行有效分離，還要確保檢測(cè)的特異性以及靈敏度，還要選用適合的檢測(cè)器來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 前處理方法

烷基鹵化物的前處理方法有頂空分析法、固相微萃取法及衍生化法。

（1）頂空分析法：埃里森等人報(bào)道了使用頂空氣相色譜（HSGC）分析23種烷基或芳基鹵化物，表明HS-GC具有良好的適用性，可用于檢測(cè)揮發(fā)性化合物，具有碘化物的反應(yīng)性最好，但溴化物反應(yīng)性最差，23種分析物的檢測(cè)下限為2．5～290ng·mL-1。他們將離子液體引入HS-GC方法并測(cè)定了8種高沸點(diǎn)烷基鹵化物，增強(qiáng)了HS-GC方法的應(yīng)用范圍，大大提高了靈敏度（10至1000倍）和較低的檢測(cè)限（5至500ng·g-1），提供了比復(fù)雜分析更經(jīng)濟(jì)可行的方法。

（2）固相微萃取法：固相微萃?。⊿PME）是一種基于萃取涂層和樣品之間的吸附，溶解和解吸平衡，集成收集，萃取和濃縮功能的技術(shù)。弗羅斯特等人使用SPME結(jié)合HS-GC方法。分析芐基氯和氯乙基甲基醚的靈敏度分別為0．3和4．0ng·mL-1。他們使用聚合離子液體作為SPME的吸附涂層，并分析了幾種烷基鹵化物。

（3）衍生化法：衍生化法是指通過(guò)化學(xué)反應(yīng)取代掉極性化合物他們的活性氫原子，從而減少檢測(cè)樣品的揮發(fā)，改善樣品的熱穩(wěn)定性以及極性。從而分離和檢測(cè)樣品。依據(jù)發(fā)生的各種反應(yīng)以及所使用的各種試劑，衍生化法把他們分為五類(lèi)，分別是烷基化、酰化、縮合、硅烷化以及酯化。衍生化在儀器分析中進(jìn)行，廣泛用于分離和萃取等。對(duì)于非揮發(fā)性烷基鹵化物，通過(guò)化學(xué)衍生化可以提高揮發(fā)性或電離效率，然后通過(guò)GC或MS方法測(cè)定。Bai等人采取衍生二甲胺溶液，通過(guò)LC-MS結(jié)合電噴霧電離分析藥物中的三種烷基氯，靈敏度為1-5ng·mL-1。

3 磺酸酯類(lèi)基因毒性雜質(zhì)研究進(jìn)展

由于藥物與磺酸形成鹽，因此具有溶解度增加，溶解速度加快，穩(wěn)定性增強(qiáng)，引濕性降低，晶體形態(tài)更穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，磺酸鹽藥物改善了有機(jī)弱堿性藥物的機(jī)械性能，如流動(dòng)性。它在粘附性，可壓縮性等方面也具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。因此，與磺酸形成鹽是改善有機(jī)弱堿藥物的成藥性質(zhì)的重要手段。據(jù)統(tǒng)計(jì)，磺酸鹽相關(guān)藥物目前正處于臨床研發(fā)和上市階段的有很多。其涉及治療的病癥包括嘔吐，哮喘，血栓，細(xì)菌感染，中風(fēng)，癌癥，艾滋病，抑郁癥等類(lèi)型?？梢钥闯?，磺酸鹽藥物的開(kāi)發(fā)和市場(chǎng)應(yīng)用是普遍和廣泛的?；撬猁}藥物通過(guò)磺酸和藥物游離堿形成鹽反應(yīng)獲得[3]。當(dāng)在合成中使用低級(jí)醇溶劑（甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇等）時(shí)，使得磺酸與這些低級(jí)醇溶劑引起副反應(yīng)產(chǎn)生磺酸酯類(lèi)雜質(zhì)。早在2000年，歐洲藥品質(zhì)量管理局（EDQM）就需要密切關(guān)注在磺酸鹽類(lèi)藥物的鹽形成過(guò)程中形成基因毒性雜質(zhì)磺酸酯的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并要求除此要檢查甲磺酸鹽中的烷基磺酸酯的限度外，還要有其他相關(guān)研究?jī)?nèi)容。隨后發(fā)生的奈非那韋甲磺酸鹽中過(guò)量的甲磺酸乙酯超標(biāo)已經(jīng)成為觸發(fā)歐洲藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)和制藥公司密切關(guān)注磺酸酯類(lèi)毒性的標(biāo)志性事件。羅氏仔細(xì)研究了生產(chǎn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)甲磺酸乙酯的殘留量超過(guò)了標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)橛糜谇鍧嵓谆撬醿?chǔ)罐的乙醇沒(méi)有完全除去，而是以更高的濃度水平保留在儲(chǔ)罐中。當(dāng)將甲磺酸存儲(chǔ)在里面的時(shí)候，就會(huì)生成一種新的物質(zhì)甲磺酸乙酯。而在羅氏把這種物質(zhì)的污染問(wèn)題進(jìn)行了相關(guān)的處理以及對(duì)這種物質(zhì)的毒性進(jìn)行了相關(guān)的分析之后，歐洲藥品評(píng)估機(jī)構(gòu)恢復(fù)了奈非那韋甲磺酸鹽在歐洲市場(chǎng)的授權(quán)。這一問(wèn)題的出現(xiàn)，給眾多的患者的生命健康都帶來(lái)了極大的隱患，不僅如此，還給羅氏也帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)和藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)高度重視對(duì)藥物中基因毒性雜質(zhì)的控制?；陲L(fēng)險(xiǎn)管理的“分階段TTC”控制策略使得對(duì)基因毒性雜質(zhì)的控制更加科學(xué)合理。酯類(lèi)是在藥品的污染雜質(zhì)中，比較常見(jiàn)的一種，而且他還是屬于基因毒性雜質(zhì)，所以可以通過(guò)優(yōu)化以及完善相關(guān)的工藝，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其有效的控制。在充分保障藥品安全的基礎(chǔ)上，盡可能減少公司的研發(fā)投入和相應(yīng)的政府監(jiān)管費(fèi)用。

4 結(jié)語(yǔ)

雖然進(jìn)行對(duì)于藥物當(dāng)中的基因毒性雜質(zhì)的相關(guān)檢測(cè)工作，在本質(zhì)上還是屬于藥物有機(jī)雜質(zhì)的檢測(cè)的范圍，但是進(jìn)行基因毒性檢測(cè)，是有著一定的靈敏度，選擇性，分析物穩(wěn)定性，基質(zhì)復(fù)雜性等特點(diǎn)，所以，是和一般的藥物檢測(cè)有著一定的區(qū)別的，基因毒性的檢測(cè)有著對(duì)相關(guān)分析方法的選擇以及開(kāi)發(fā)要求較苛刻的特點(diǎn)。許多基因毒性雜質(zhì)具有強(qiáng)烈或不穩(wěn)定的反應(yīng)性，不能直接測(cè)量。一般都是進(jìn)行利用衍生化法將這些雜質(zhì)轉(zhuǎn)化成較為穩(wěn)定一些的化合物，再進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)工作。此外，藥物的復(fù)雜成分可能引起基質(zhì)效應(yīng)并影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。通常通過(guò)各種提取技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行分離，純化和富集，然后進(jìn)行分析測(cè)量不僅可以提高檢測(cè)靈敏度，還可以降低基質(zhì)效應(yīng)并獲得更好的測(cè)量結(jié)果。