遠(yuǎn)志提取物改善老年大鼠記憶功能及對(duì)海馬、皮質(zhì)氧化自由基代謝的影響

任子顧，許保海

老年人在衰老及諸多基礎(chǔ)性疾病的作用下，機(jī)體逐漸進(jìn)入至各項(xiàng)功能自然衰退期。氧化自由基水平異常升高為機(jī)體衰老、諸多退行性病變的重要誘因。衰老可引起氧化自由基代謝障礙，對(duì)膽堿能系統(tǒng)造成損傷，誘發(fā)大腦海馬神經(jīng)元、皮質(zhì)結(jié)構(gòu)等發(fā)生異常改變，造成陳述性記憶功能受損，并可逐漸進(jìn)展為阿爾茨海默癥(alzheimer’s disease，AD)[1-3]。因此，阻斷或延緩這一進(jìn)程對(duì)于抗衰老、改善老年人記憶功能及預(yù)防AD均具有重要意義。然而，目前臨床上對(duì)于這一進(jìn)程尚無(wú)特效藥物，西藥治療本病療效欠佳，且因副作用較大，長(zhǎng)期應(yīng)用患者耐受度較低。遠(yuǎn)志中醫(yī)常用的益智類(lèi)藥物，其主要成分為遠(yuǎn)志皂苷、寡糖脂類(lèi)等活性物，具有改善記憶力、抗氧化、抗衰老、抗炎及保護(hù)神經(jīng)等功效。遠(yuǎn)志提取物具有改善AD小鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能及減少腦β淀粉樣蛋白積聚的功效，但其作用機(jī)制尚未能完全明晰[4-6]。目前，臨床上關(guān)于遠(yuǎn)志改善AD患者及動(dòng)物模型記憶、認(rèn)知功能等的研究較多，但正常衰老相關(guān)的研究較少。因此，本研究以老年大鼠為觀察資料，客觀評(píng)估遠(yuǎn)志提取物對(duì)老年大鼠記憶功能的作用，以及其對(duì)老年大鼠大腦海馬體、皮質(zhì)氧化自由基代謝的影響。

1材料與方法

1.1 材料 由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供24只24月齡的老年Wistar大鼠，隨機(jī)分為2組，老年非用藥組、老年用藥組，每組12只，另選取12只6月齡的青年大鼠為對(duì)照組，全部大鼠均為雄性。對(duì)照組大鼠體重為150～210g，平均(182.65±5.64)g，老年非用藥組大鼠體重為380～490 g，平均(435.17±2.31)g，老年用藥組大鼠體重為370～510 g，平均(436.12±2.47)g。老年大鼠體重高于青年大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2組老年大鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

遠(yuǎn)志購(gòu)自于同仁堂中藥飲片公司。提取物制備，按遠(yuǎn)志體積分?jǐn)?shù)75%量取乙醇進(jìn)行浸泡，后以超聲破碎，過(guò)濾殘?jiān)笫褂们研推啃?，獲得膏狀提取物。使用時(shí)以聚乙二醇加蒸餾水充分溶解。

一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒及硫代巴比妥酸均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技公司。SPECTRUM、SP-2000UV紫外線可見(jiàn)光光度計(jì)購(gòu)自上海光譜儀器公司。水迷宮實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟軟件公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干預(yù)方法 老年非用藥組與對(duì)照組均不予任何干預(yù)，正常喂養(yǎng)，自由食水自由活動(dòng)3個(gè)月。老年用藥組給予遠(yuǎn)志提取物溶液200 μl，其中遠(yuǎn)志提取物含量為200 mg/kg，灌胃，1次/d，維持3個(gè)月。

1.2.2 記憶功能 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[7]評(píng)估。干預(yù)3個(gè)月后，行 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，在訓(xùn)練泳池水中加入牛奶使水質(zhì)渾濁，水溫控制在22 ℃左右。水池劃分為東、南、西、北4個(gè)象限，將平臺(tái)置于某1個(gè)象限中央，使池水沒(méi)過(guò)平臺(tái)約3 cm。第1-5天行定位航行訓(xùn)練，第1天將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入池中游泳120 s適應(yīng)水池環(huán)境；第2天于某1個(gè)象限內(nèi)置入平臺(tái)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按順序從各象限朝池壁方向放入池水中，開(kāi)始獲得訓(xùn)練，記錄大鼠尋找到平臺(tái)的用時(shí)，逃避潛伏期設(shè)置為120 s，將120 s內(nèi)未能尋找平臺(tái)的大鼠引導(dǎo)至平臺(tái)停留10 s，1次/d，連續(xù)訓(xùn)練5 d，第5天訓(xùn)練結(jié)束時(shí)為結(jié)果數(shù)據(jù)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，除去平臺(tái)，開(kāi)展空間搜索實(shí)驗(yàn)，記錄全部大鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)位置的次數(shù)、在平臺(tái)象限的停留時(shí)間、平臺(tái)直徑2倍范圍的有效區(qū)內(nèi)停留時(shí)間、游泳總路程。實(shí)驗(yàn)全程共計(jì)6 d，1次/d。

1.2.3 氧化自由基代謝 以NO、MDA、SOD、CAT水平為氧化自由基代謝評(píng)估指標(biāo)。于全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h內(nèi)，處死全部大鼠，斷頭取腦，使用0 ℃生理鹽水進(jìn)行沖洗，迅速分離海馬體與大腦皮質(zhì)。于0 ℃條件下超聲粉碎海馬體與大腦皮質(zhì)組織，制備為100 g/L的組織勻漿；溫度4 ℃，3000 r/min，離心15 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存待檢。按硫代巴比妥酸法檢測(cè)上述上清液中NO、MDA、SOD、CAT水平。

1.2.4 組織學(xué)檢查及細(xì)胞計(jì)數(shù) 斷頭取腦，用甲醛溶液固定，制作石蠟切片，內(nèi)氏體染色，光鏡下觀察海馬細(xì)胞形態(tài)變化。行常規(guī)石蠟包埋、切片，H-E染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)1 mm2(×50)取雙側(cè)海馬細(xì)胞數(shù)的均值。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮試驗(yàn) 各組水迷宮試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步對(duì)比，對(duì)照組青年大鼠第5天逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間、有效區(qū)停留時(shí)間、游泳路程均優(yōu)于其他各組，其次為老年用藥組，老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 海馬氧化自由基代謝指標(biāo) 各組大鼠海馬體NO、MDA、SOD、CAT水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步對(duì)比，對(duì)照組青年大鼠海馬組織NO、MDA、SOD、CAT水平均優(yōu)于其他各組，其次為老年用藥組，老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

指標(biāo)對(duì)照組老年非用藥組老年用藥組FP第5天逃避潛伏期(s)24.05±3.4747.15±4.71①31.11±4.06①②187.6310.000穿越平臺(tái)次數(shù)(次)4.75±0.482.69±0.36①3.45±0.61①②58.3870.000平臺(tái)象限停留時(shí)間(s)40.10±5.2423.16±4.92①34.76±5.00①②36.3940.000有效區(qū)停留時(shí)間(s)16.99±1.3010.34±0.86①14.85±0.93①②198.2540.000游泳路程(cm)313.57±16.29203.65±14.02①291.54±14.82①②185.4360.000

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與老年非用藥組比較，②P<0.05

指標(biāo)對(duì)照組老年非用藥組老年用藥組FPNO(μmol/g)39.15±5.2994.85±7.02①47.33±6.47①②239.1960.000MDA(μmol/g)16.73±1.7731.64±5.43①20.23±4.22①②43.4780.000SOD(μU/g)114.06±6.0139.15±4.58①91.58±5.13①②625.1870.000CAT(U/mg)5.18±0.752.03±0.79①4.09±0.88①②56.4380.000

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與老年非用藥組比較，②P<0.05

2.3 大腦皮質(zhì)氧化自由基代謝指標(biāo) 各組大鼠大腦皮質(zhì)NO、MDA、SOD、CAT水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步對(duì)比，對(duì)照組青年大鼠大腦皮質(zhì)組織NO、MDA、SOD、CAT水平均優(yōu)于其他各組，其次為老年用藥組，老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

指標(biāo)對(duì)照組老年非用藥組老年用藥組FPNO(μmol/g)38.03±4.1369.68±7.28①45.53±5.17①②147.1830.000MDA(μmol/g)14.98±1.9428.74±5.37①19.40±4.4①②36.5270.000SOD(μU/g)121.25±7.0242.19±5.27①95.45±4.54①②597.5140.000CAT(U/mg)6.18±0.813.04±0.65①5.18±0.82①②67.5020.000

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與老年非用藥組比較，②P<0.05

2.4 各組大鼠海馬形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果及計(jì)數(shù)比較 對(duì)照組大鼠海馬錐體細(xì)胞層結(jié)構(gòu)緊密，層次豐富。老年非用藥組海馬錐體細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞線變得不清晰。老年用藥組海馬錐體細(xì)胞線清晰，明顯優(yōu)于老年非用藥組。對(duì)照組錐體細(xì)胞核大、染色淺、細(xì)胞質(zhì)豐富、細(xì)胞排列緊密。老年非用藥組形態(tài)正常的細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核固縮，有的形成碎片。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)氏體減少，細(xì)胞排列稀疏、形態(tài)異常。老年用藥組細(xì)胞排列緊密、數(shù)量明顯增多，內(nèi)氏體豐富，僅見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞變性。單位面積細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為對(duì)照組(152.21±17.34)、老年非用藥組(72.23±23.38)、老年用藥組(138.27±24.97)，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

隨著我國(guó)社會(huì)老齡化結(jié)構(gòu)逐漸加深，全社會(huì)對(duì)于抗衰老課題亦日漸重視。自由基損傷誘導(dǎo)衰老理論目前已經(jīng)達(dá)成廣泛共識(shí)。人體內(nèi)的諸多自由基可隨年齡增長(zhǎng)而積聚，特別是過(guò)度的氧自由基可誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞損傷與凋亡，從而導(dǎo)致記憶功能、認(rèn)知能力等衰退。人體的大腦與其他重要器官相比，抗氧化的能力相對(duì)更為羸弱，對(duì)于氧化損傷具有高度敏感性，自由基的過(guò)度積累可逐步形成海馬神經(jīng)元的變性，造成認(rèn)知功能減退。學(xué)習(xí)、記憶功能為腦部高級(jí)功能，學(xué)習(xí)記憶功能衰退標(biāo)志著腦功能的全面退化，為腦衰老的一項(xiàng)重要表現(xiàn)。氧化應(yīng)激反應(yīng)為腦衰老相關(guān)神經(jīng)功能退行性病變的一項(xiàng)重要誘因。因此，拮抗氧自由基相關(guān)損傷已經(jīng)成為了防治腦衰老相關(guān)疾病的新途徑。腦組織中的NO、MDA、SOD、CAT含量均為腦細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化程度與細(xì)胞損傷的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。正常健康狀態(tài)下，機(jī)體所產(chǎn)生的氧自由基及其清除系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)平衡，一旦這一平衡機(jī)制發(fā)生紊亂，作為主要抗氧化酶活性物質(zhì)SOD的水平下降，氧自由基過(guò)度積聚，形成氧化應(yīng)激性損傷，使體內(nèi)脂質(zhì)的過(guò)氧化物MDA水平上升，久之誘發(fā)細(xì)胞膜的損傷，組織器官的功能受損，機(jī)體各器官功能進(jìn)入至衰退期[8-10]。過(guò)度氧自由基損傷為老年性癡呆、AD、認(rèn)知功能障礙等諸多神經(jīng)退行性病變的一項(xiàng)重要誘因與致病基礎(chǔ)[11，12]。因此，清除過(guò)度氧自由基為延緩衰老、預(yù)防衰老相關(guān)腦疾病的一項(xiàng)重要措施。

眾所周知，抗衰老為人類(lèi)一貫致力研究的重要課題，但目前仍尚未發(fā)現(xiàn)特效方法，我國(guó)中醫(yī)學(xué)在這一領(lǐng)域擁有悠久歷史與豐富經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腦衰老是因腦髓失養(yǎng)引發(fā)，《醫(yī)林改錯(cuò)》中指出，年高者記性漸減，因腦髓漸空所致[13]，且患者多因痰濕上擾心神而使神智失節(jié)。因此治療中應(yīng)選用益智、祛痰類(lèi)藥物。遠(yuǎn)志為中醫(yī)學(xué)臨床上常用的益智類(lèi)藥物，其為多年生草本植物，具有益智安神、祛痰消腫等功效，主要應(yīng)用于神忡智昏、驚悸健忘、神志恍惚、心腎不交導(dǎo)致的失眠多夢(mèng)等癥的臨床治療中[14，15]。

本研究采用動(dòng)物模式研究了遠(yuǎn)志對(duì)老年大鼠記憶功能的改善作用，及其對(duì)大鼠海馬、腦皮質(zhì)氧化自由基代謝的影響。本研究選用青年大鼠作為對(duì)照組，另將老年大鼠分別納入不進(jìn)行任何干預(yù)的老年非用藥組以及以遠(yuǎn)志干預(yù)的老年用藥組。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組大鼠水迷宮各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均優(yōu)于各老年大鼠組，在老年大鼠中老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組。由此可知，老年大鼠存在明確的記憶功能衰退，經(jīng)遠(yuǎn)志干預(yù)后可改善老年大鼠的記憶功能，但3個(gè)月的干預(yù)期內(nèi)未能達(dá)到健康青年大鼠水平。對(duì)各組大鼠腦部海馬、皮質(zhì)組織進(jìn)行化驗(yàn)對(duì)比的結(jié)果表明，對(duì)照組青年大鼠海馬與大腦皮質(zhì)組織中NO、MDA、SOD、CAT水平均優(yōu)于老年大鼠，在老年大鼠中老年用藥組優(yōu)于老年非用藥組。由此可知，遠(yuǎn)志能夠改善老年大鼠海馬、皮質(zhì)組織中氧化自由基的代謝功能，提高過(guò)氧化物清除能力，但仍未能達(dá)到健康青年大鼠的清除能力。本研究亦發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志提取物能夠改善老年用藥組的細(xì)胞形態(tài)，單位面積細(xì)胞計(jì)數(shù)較老年非用藥組更佳，但亦不及對(duì)照組。延長(zhǎng)遠(yuǎn)志的應(yīng)用時(shí)間是否可進(jìn)一步擴(kuò)大上述功能有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，遠(yuǎn)志提取物能夠改善老年大鼠記憶功能，這一改善功效主要與遠(yuǎn)志有效改善海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)，提高了老年大鼠腦海馬、皮質(zhì)組織中氧化自由基代謝功能，增強(qiáng)了腦部過(guò)氧化物清除能力的機(jī)制相關(guān)。