王怡婷 楊恒 張新笑 張坤 王道營(yíng) 鄒燁 徐為民
摘要:鵝肝是肉制品加工過(guò)程中一種極為普遍的副產(chǎn)物,由于其含有十分豐富的營(yíng)養(yǎng),常常會(huì)被作為食物。但是只有小部分鵝肝被人們食用,大部分鵝肝被加工處理為動(dòng)物飼料或是直接丟棄,從而造成了很嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。以鵝肝為原料,采用三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖液中為提取劑,采用超聲輔助法提取鵝肝蛋白質(zhì),并與常規(guī)水浴提取作比較。通過(guò)對(duì)比二者圓二色譜、傅里葉紅外光譜、凝膠電泳等結(jié)果,研究超聲輔助提取對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明,與常規(guī)水浴提取鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲處理引起部分蛋白質(zhì)水解和折疊,導(dǎo)致其表面疏水性顯著提高,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。通過(guò)對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)進(jìn)行凝膠電泳的測(cè)定,結(jié)果表明,超聲輔助提取鵝肝蛋白質(zhì)并沒(méi)有改變鵝肝蛋白質(zhì)的亞基組成。同時(shí)對(duì)溶解度、起泡性和乳化性質(zhì)這些物化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)鵝肝蛋白質(zhì)在超聲輔助提取下的物化性質(zhì)明顯提高。通過(guò)對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)性質(zhì)的研究,希望能為鵝肝蛋白質(zhì)的深加工提供一定的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ),進(jìn)一步提高鵝肝的利用率。
關(guān)鍵詞:鵝肝蛋白質(zhì);超聲輔助;物化性質(zhì);結(jié)構(gòu)特性
中圖分類號(hào): TS251.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號(hào):1002-1302(2019)18-0240-07
收稿日期:2018-05-24
基金項(xiàng)目:國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉雞)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(編號(hào):CARS-41);江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào):CX(16)1007];江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)研究基金[編號(hào):ZX(16)2041]。
作者簡(jiǎn)介:王怡婷(1996—),女,江蘇常熟人,主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。E-mail:842358674@qq.com。
通信作者:鄒?燁,博士,助理研究員,主要從事動(dòng)物源食品加工與質(zhì)量控制研究。E-mail:zouye@jaas.ac.cn。
鵝肝是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、附加值較高的肉制品加工副產(chǎn)物,是世界三大美食之一,同時(shí)也是一種極佳的滋養(yǎng)品[1]。鵝肝中富含營(yíng)養(yǎng)素,如蛋白質(zhì)、維生素、脂肪等,同時(shí)還含有人體所需的各種礦質(zhì)元素,如鐵、鋅、銅、鉀、磷、鈉、硒等。鵝肝中的硒具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用,同時(shí)硒對(duì)黃曲霉毒素B1的致癌性有破壞作用,可提高機(jī)體免疫力[2]。目前,我國(guó)的鵝肝一部分直接被食用,一部分用來(lái)加工成動(dòng)物飼料,只有少量被深加工為鵝肝醬,因此造成大量鵝肝優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。肝臟中的蛋白質(zhì)被完全不同于肌肉蛋白質(zhì),肝臟蛋白質(zhì)種類繁多,特性各異,有水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白質(zhì)等,這也是肝臟蛋白質(zhì)完全提取出來(lái)的難點(diǎn)。因此急需尋找合適、高效、環(huán)保的方法將鵝肝蛋白質(zhì)提取出來(lái)。
目前,微波輔助提取法在蛋白質(zhì)提取中被廣泛使用。該方法通過(guò)高頻電磁波穿透介質(zhì)到達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)內(nèi)部,微波熱能不斷被細(xì)胞吸收,使得細(xì)胞內(nèi)溫度升高,細(xì)胞壁無(wú)法承受細(xì)胞內(nèi)部帶來(lái)的壓力,進(jìn)而破壞了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,使得有效成分在溶劑中的溶解速度加快,通過(guò)進(jìn)一步分離和過(guò)濾,最終獲得所需提取物[3]。超聲波是一種安全高效的技術(shù),超聲輔助提取作為一種新型的非熱物理加工技術(shù),適用于不同來(lái)源的生物活性物質(zhì)提取,特別是在蛋白質(zhì)提取等食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景,它在促進(jìn)食品中有效成分的提取方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),具有促進(jìn)酶解、提高提取率、溶劑用量少和蛋白質(zhì)提取率高等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。到目前為止,關(guān)于超聲波對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)物化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的研究報(bào)道較少。因此,本研究采用超聲輔助提取鵝肝蛋白質(zhì),并進(jìn)一步對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析,以期為肉制品加工副產(chǎn)物鵝肝蛋白質(zhì)在食品等領(lǐng)域的潛在利用價(jià)值研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。
1?材料與方法
1.1?材料與儀器
1.1.1?試驗(yàn)材料
鵝肝蛋白質(zhì)凍干品,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所畜禽產(chǎn)品加工研究室提供。
1.1.2?主要試劑
1-苯氨基-8-萘磺酸鹽(ANS)、β-巰基乙醇[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司];蛋白標(biāo)記(上海源葉生物科技有限公司);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、尿素、氫氧化鈉(西隴化工股份有限公司);考馬斯亮藍(lán)、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS,南京榮勝達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);鹽酸(揚(yáng)州滬寶化學(xué)試劑有限公司);三氯乙酸(TCA,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。
1.1.3?試驗(yàn)儀器
FL-4600熒光分光光度計(jì)(日本日立高新技術(shù)公司);UV-6100型分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司);Uncen MR臺(tái)式冷凍離心機(jī)(英國(guó)Hero Lab公司);M124A電子天平(意大利倍爾公司);便攜式pH計(jì)[美國(guó)奧豪斯儀器(上海)有限公司];T25 D S25高速粉碎機(jī)(德國(guó)IKA公司);STA-449C差示量熱掃描儀(德國(guó)耐馳公司);Jasco-715圓二色譜儀[佳司科(上海)貿(mào)易有限公司];真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ公司);HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋、HJ-8(DF-1)集熱式磁力攪拌器(江蘇省常州國(guó)華電器有限公司)。
1.2?試驗(yàn)方法
1.2.1?鵝肝蛋白質(zhì)的提取工藝
鵝肝脫脂。取一定量新鮮鵝肝(10 g)進(jìn)行勻漿(8 819 r/min,30 s),在勻漿后的新鮮鵝肝中加入體積分?jǐn)?shù)為10%的異丙醇脫脂,靜置一段時(shí)間后,8 819 r/min 離心15 min,收集沉淀,干燥。
常規(guī)水浴提取。取10 g脫脂鵝肝,加入60 mL Tris-HCl(0.02 mol/L,pH值為8.0)緩沖液,在30 ℃下,磁力攪拌70 min。接著于8 819 r/min離心15 min。最后將上清液真空冷凍干燥44 h,得到常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)。
超聲輔助提取。取10 g脫脂鵝肝,加入60 mL Tris-HCl(0.02 mol/L,pH值為8.0)緩沖液,在超聲波提取儀中提取一定時(shí)間(70 min,240 W,100 Hz,30 ℃)。接著于8 819 r/min 離心15 min。最后將上清液真空冷凍干燥44 h,得到超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)。
1.2.2?鵝肝蛋白質(zhì)性質(zhì)的測(cè)定
1.2.2.1?鵝肝蛋白質(zhì)的凝膠電泳測(cè)定
制備12%分離膠和5%濃縮膠,在常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)中加入上樣緩沖液,沸水浴10 min,于9 661 r/min離心3 min。取15 μL上清液上樣。采用蛋白marker(10~180 ku)作為對(duì)照,加入1 L電泳緩沖液,電泳先在電流為16 mA的條件下進(jìn)行15 min,然后再在32 mA下進(jìn)行1 h。電泳結(jié)束后,采用考馬斯亮藍(lán)染色20 min,通過(guò)脫色液進(jìn)行脫色,直至可以清楚辨別條帶為止。
1.2.2.2?鵝肝蛋白質(zhì)的傅里葉紅外光譜測(cè)定
將常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)和超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)用傅立葉紅外光譜分析儀進(jìn)行測(cè)定。掃描條件:掃描范圍為650~4 000 cm,掃描264次,分辯率為4 cm。
1.2.2.3?鵝肝蛋白質(zhì)的差式掃描量熱(DSC)測(cè)定
稱取3~6 mg鵝肝蛋白質(zhì)樣品,用差示量熱掃描儀進(jìn)行掃描。在氮?dú)猸h(huán)境下進(jìn)行測(cè)定;掃描溫度為20 ℃,掃描速度為5 ℃/min。
1.2.2.4?鵝肝蛋白質(zhì)的圓二色譜測(cè)定
采用圓二色譜儀測(cè)定樣品溶液的遠(yuǎn)紫外光譜變化。在1 mm厚的樣品池中注入濃度為0.25 mg/mL的鵝肝蛋白質(zhì)液樣品。通過(guò)分光偏振計(jì)在20 ℃下于190~250 nm之間記錄左旋和右旋圓偏振光吸收差,帶寬為1.0 nm,掃描速率為100 nm/min。將磷酸鹽緩沖液光譜作為空白從平均值中減去,獲得每個(gè)樣品的校正光譜,試驗(yàn)平行3次。
1.2.2.5?鵝肝蛋白質(zhì)的熒光光譜測(cè)定
使用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)制備0.2 mg/mL常規(guī)提取和超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)溶液,用熒光分光光度計(jì)對(duì)這2種溶液進(jìn)行測(cè)定。激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍為300~460 nm,狹縫寬度為2.5 nm。
1.2.2.6?鵝肝蛋白質(zhì)的掃描電鏡測(cè)定
采用掃描電子顯微鏡對(duì)冷凍干燥后的常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)和超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行觀測(cè)和攝圖,對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行離子濺射儀真空干燥、金粉噴鍍處理,將電鏡加速電壓調(diào)整為20 kV。
1.2.2.7?鵝肝蛋白質(zhì)的表面疏水性
稱取4 mg常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)樣品和超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)樣品,加入4 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0),配制成鵝肝蛋白質(zhì)溶液。加入16 μL 8 mmol/L ANS磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0),混勻之后在室溫下放置2 min。通過(guò)熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)371 nm、發(fā)射波長(zhǎng)467 nm、掃描速率240 nm/min、狹縫寬度10 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)濃度作圖,外推至鵝肝蛋白質(zhì)濃度為0,曲線的初始斜率即為鵝肝蛋白質(zhì)的表面疏水性。
1.2.2.8?鵝肝蛋白質(zhì)的自由巰基(SH)和總巰基的測(cè)定
自由巰基。取10 mg/mL鵝肝蛋白質(zhì)液樣品0.5 mL,然后迅速加入2.5 mL三羥基甲基氨基甲烷-甘氨酸-8M尿素(Tris-Gly-8M Urea)溶液和0.02 mL二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)溶液(4 mg/mL),25 ℃保溫反應(yīng)25 min,在波長(zhǎng)412 nm 下測(cè)定吸光度(D412 nm),以蒸餾水作為空白對(duì)照。作3次平行試驗(yàn),取其平均值,并按式(1)進(jìn)行計(jì)算:
自由巰基含量(μmol/g)=73.53D412 nm×D/C。(1)
式中:C為蛋白質(zhì)樣品的濃度,mg/mL;D為稀釋因子,在對(duì)游離巰基的測(cè)定中D取6.04。
總巰基/二硫鍵(SS)。將0.2 mL鵝肝蛋白質(zhì)液樣品(10 mg/mL)、1.0 mL Tris-Gly-10M Urea溶液和0.02 mL β- 巰基乙醇混合均勻,在25 ℃水浴鍋中保溫反應(yīng)1 h,然后在混合液中加入12%三氯乙酸溶液10 mL,接著繼續(xù)在水浴鍋中保溫反應(yīng)1 h。保溫反應(yīng)結(jié)束后用離心機(jī)于6 236 r/min 離心10 min,棄去上清液,用12%三氯乙酸溶液將沉淀物洗滌。在沉淀物中依次加入3.0 mL Tris-Gly-8M Urea、0.03 mL DTNB溶液,25 ℃保溫反應(yīng)25 min。最后在波長(zhǎng)412 nm 下測(cè)其吸光度(D412 nm),以蒸餾水作為空白對(duì)照。作3次平行試驗(yàn),取其平均值,并按式(2)進(jìn)行計(jì)算:
總巰基含量(μmol/g)=73.53D412 nm×D/C。(2)
式中:D取15。
二硫鍵含量按式(3)計(jì)算:
二硫鍵含量(μmol/g)=(總巰基含量-游離巰基含量)/2。(3)
1.2.2.9?鵝肝蛋白質(zhì)的溶解性測(cè)定
制備pH值分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0的鵝肝蛋白質(zhì)溶液。配制6份5 mg/mL鵝肝蛋白質(zhì)液樣品各25 mL于錐形瓶中,然后用適當(dāng)濃度的HCl與NaOH溶液調(diào)節(jié)鵝肝蛋白質(zhì)溶液的pH值。水浴搖床振蕩(室溫,1 247 r/min,30 min),最后于5 218 r/min 離心30 min。在595 nm下,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度。
1.2.2.10?鵝肝蛋白質(zhì)的起泡性測(cè)定
配制4種不同濃度的鵝肝蛋白質(zhì)溶液各50 mL,溶液濃度分別為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%,將溶液pH值調(diào)為7.0,在30 ℃下磁力攪拌1 h,接著將溶液全部轉(zhuǎn)移至100 mL量筒內(nèi),測(cè)定此時(shí)溶液的高度(h1),然后將溶液用勻質(zhì)機(jī)在8 819 r/min下勻質(zhì)30 s,立即測(cè)定攪拌后的高度(h2);再分別測(cè)量60 min后樣品的高度(h3),計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性。
起泡性=h1h2×100%;(4)
起泡穩(wěn)定性=h3h2×100%。(5)
1.2.2.11?鵝肝蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)測(cè)定
通過(guò)分光光度法測(cè)定常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)。用鵝肝蛋白質(zhì)樣品和0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液配制鵝肝蛋白質(zhì)溶液(1 g ∶20 mL)30 mL。接著加入玉米油,使混合液總體積為40 mL。將混合液用均質(zhì)機(jī)于8 819 r/min均質(zhì)1 min。乳狀液靜置待用。
取50 μL底部乳狀液,加入4 950 μL 0.1%十二烷基硫酸鈉溶液將鵝肝蛋白質(zhì)稀釋100倍。接著在500 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定0 min時(shí)的吸光度D0(500 nm)和10 min時(shí)的吸光度D10(500 nm),以0.1%十二烷基硫酸鈉溶液作空白對(duì)照,計(jì)算乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI):
EAI(m2/g)=2×2.303C(1-)×10 000×D0(500 nm)×100;(6)
ESI(min)=10×D0(500 nm)D0(500 nm)-D10(500 nm)。(7)
式中:C為樣品濃度;為大豆油的體積分?jǐn)?shù),%。
1.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
上述所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù),結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,Turkey檢驗(yàn)用于2組間的數(shù)據(jù)分析,P<0.05表示2組之間具有顯著性差異,采用Origin 9.0軟件作圖。
2?結(jié)果與分析
2.1?鵝肝蛋白質(zhì)的凝膠電泳分析
通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析得到常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)及其分離組分的亞基組成情況。由圖1可知,常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)與超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)的所有條帶基本相同,鵝肝蛋白質(zhì)的亞基相對(duì)分子量主要集中在36~72 ku、17~30 ku。這個(gè)研究結(jié)果與Zhang等用超聲處理提取花生蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果[6]是相似的,蛋白質(zhì)條帶均完整,且未發(fā)現(xiàn)額外碎的條帶出現(xiàn),說(shuō)明鵝肝蛋白質(zhì)的亞基組成并沒(méi)有因超聲處理而發(fā)生改變[7]。
2.2?鵝肝蛋白質(zhì)的傅里葉紅外光譜分析
傅里葉紅外光譜法是分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的一種常用方法。蛋白質(zhì)的肽鍵是一種酰胺鍵,它在紅外區(qū)有特征吸收峰,其中酰胺Ⅰ帶對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析最為重要,酰胺Ⅰ帶在某種程度上可以反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),酰胺Ⅰ帶上具有1個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化最為敏感的最大吸收峰(波數(shù)為1 648 cm-1),因此可通過(guò)紅外光譜對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[8]。由圖2可知,常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)和超聲提取的鵝肝蛋白質(zhì)在波數(shù)為1 500~1 700 cm-1之間具有相同特征的最大吸收峰。與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲提取的鵝肝蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化更為明顯。任曉峰采用雙頻超聲處理玉米醇溶蛋白質(zhì)在波數(shù)為1 648 cm-1 處具有相同特征最大吸收峰的結(jié)果與本研究結(jié)果是一致的,表明采用超聲處理對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了重要影響[9]。
2.3?鵝肝蛋白質(zhì)的差式掃描量熱分析
鵝肝蛋白質(zhì)經(jīng)超聲處理后,分子內(nèi)部的氫鍵被打開(kāi),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞,DSC可以用來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞過(guò)程中熱焓值的變化趨勢(shì)[10]。由圖3可知,常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)與超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)都存在2個(gè)特征峰,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)沒(méi)有因?yàn)槌暡ǖ奶幚矶ヌ卣鞣澹⑶页曒o助提取的鵝肝蛋白質(zhì)熱變性溫度低于常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì),說(shuō)明超聲提取的鵝肝蛋白質(zhì)沒(méi)有變性。由表1可知,常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)的峰值溫度為(128.1±4.8) ℃,熱焓值為(39.8±1.9) ℃;超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)的峰值溫度為(115.0±3.3) ℃,熱焓值為(30.1±1.6) ℃。與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)峰值溫度降低了10.23%,熱焓值下降了24.4%,二者間均具有顯著性差異??赡艿脑蚴堑鞍踪|(zhì)溶液中的聚集體因?yàn)榻?jīng)過(guò)了超聲處理變得松散,在熱變性過(guò)程中,蛋白質(zhì)分子對(duì)溫度的敏感程度增加,蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞[11]。結(jié)果表明,超聲處理可以使鵝肝蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性降低。
2.4?鵝肝蛋白質(zhì)的圓二色譜分析
圓二色譜能夠反映蛋白質(zhì)主鏈肽鍵的構(gòu)象,是檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化的重要指標(biāo),其遠(yuǎn)紫外圖像(190~250 nm)能夠提供蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲)含量的信息(圖4)[12-13]。由表2可知,與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲處理后鵝肝蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊的比例下降了31.7百分點(diǎn),α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲的比例略有上升,分別上升了6.0、9.9百分點(diǎn),β-轉(zhuǎn)角的比例增加了15.7百分點(diǎn)。這與楊勇等采用超聲處理綠豆蛋白質(zhì),α-螺旋含量下降,β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量增加的研究結(jié)果[14]相一致。馮景麗等利用超聲處理酪蛋白質(zhì),導(dǎo)致α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量下降,這可能是由于經(jīng)超聲處理后,蛋白質(zhì)分子內(nèi)部氫鍵發(fā)生變化,導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)松散[15]。結(jié)果表明,超聲處理會(huì)破壞鵝肝蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
2.5?鵝肝蛋白質(zhì)的熒光光譜分析
熒光光譜可以通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)中部分能產(chǎn)生熒光的氨基酸殘基(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)來(lái)推測(cè)其蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化趨勢(shì),是表征蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生變化的另一種手段[16],通過(guò)熒光強(qiáng)度和峰位的變化可以反映蛋白質(zhì)局部三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[17]。由圖5可知,常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)和超聲提取的鵝肝蛋白質(zhì)在波長(zhǎng)330~340 nm處的熒光強(qiáng)度最高,熒光強(qiáng)度的最高峰沒(méi)有發(fā)生變化。與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,采用超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度明顯提高,并且熒光強(qiáng)度有不同程度的變化趨勢(shì),可能是由于鵝肝蛋白質(zhì)經(jīng)超聲處理后,蛋白質(zhì)內(nèi)部分子伸展,其分子間作用力遭到破壞,暴露出部分色氨酸基團(tuán),從而使熒光強(qiáng)度發(fā)生了一定的改變[18]。賈俊強(qiáng)等通過(guò)超聲處理麥胚清蛋白質(zhì)后,其熒光強(qiáng)度明顯提高[19]。采用超聲輔助提取可以改變鵝肝蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象,這可能與超聲處理時(shí)產(chǎn)生的剪切力有關(guān)[20]。
2.6?鵝肝蛋白質(zhì)的掃描電鏡分析
由圖6可知,常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)呈塊狀堆積結(jié)構(gòu)。與常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相比,經(jīng)超聲處理的鵝肝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松,出現(xiàn)很多微孔。這些微觀結(jié)構(gòu)的變化可能是由于鵝肝蛋白質(zhì)分子間氫鍵和范德華力被超聲波的空化作用產(chǎn)生的局部微射流及震蕩波所產(chǎn)生的剪切力破壞了,從而使蛋白后表面暴露出更多的巰基和疏水性基團(tuán),最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,粒徑減小,使得蛋白質(zhì)聚集體發(fā)生分散,形成更加寬松的層狀結(jié)構(gòu)[21],這與馮景麗等采用超聲處理酪蛋白質(zhì)表面微觀結(jié)構(gòu)變得片層化和“空洞”化是一致的[15]。鵝肝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)超聲處理會(huì)產(chǎn)生巨大的變化,其表面微觀結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生明顯變化。
2.7?鵝肝蛋白質(zhì)的疏水性分析
表面疏水性是蛋白質(zhì)的重要特性之一,研究表明,表面疏水性是影響蛋白質(zhì)功能特性的重要因素,對(duì)保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定構(gòu)象及其生物活性具有重要作用[22]。熒光探針?lè)ㄊ悄壳暗鞍踪|(zhì)表面疏水性測(cè)定中應(yīng)用最廣泛的一種方法,它具有蛋白質(zhì)用量少和操作簡(jiǎn)單、便捷等特點(diǎn)[23]。ANS熒光探針在水溶液中單獨(dú)存在時(shí),熒光量子產(chǎn)量較低,隨著ANS與蛋白質(zhì)結(jié)合,熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),通過(guò)這一特性可以表征鵝肝蛋白質(zhì)的表面疏水性[24]。由圖7可知,與常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)表面疏水性增加,表明超聲處理破壞了鵝肝蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),在水溶液中暴露出疏水性氨基酸,更多的鵝肝蛋白質(zhì)與ANS相結(jié)合,熒光強(qiáng)度增強(qiáng),其表面疏水性顯著提高[25]。賈俊強(qiáng)等發(fā)現(xiàn),通過(guò)超聲頻率為1 800 W 的超聲波處理后小麥胚芽球蛋白質(zhì)溶液的表面疏水性得到了提高[26]。通過(guò)超聲輔助提取,可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,蛋白質(zhì)伸展時(shí),其表面疏水性可以得到提高[8]。
2.8?鵝肝蛋白質(zhì)的自由巰基和總巰基分析
巰基含量的變化程度有助于判斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性的程度[27]。如圖8所示,與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)的自由巰基和總巰基含量都有明顯增加。有可能由于超聲處理使鵝肝蛋白質(zhì)溶液中分子間的二硫鍵斷裂,使原本的二硫鍵斷裂成巰基,破壞了鵝肝蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu),最終造成鵝肝蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)伸展[28]。此外還可能由于鵝肝蛋白質(zhì)溶液的復(fù)雜性,其蛋白質(zhì)溶液是混合物
而不是純蛋白質(zhì)溶液[25]。
2.9?鵝肝蛋白質(zhì)的溶解度分析
溶解度是衡量蛋白質(zhì)變性和聚集的重要指標(biāo)之一,是蛋白質(zhì)的重要功能性質(zhì)之一[29]。由圖9可知,鵝肝蛋白質(zhì)的pH值-溶解度曲線基本符合“V”形。鵝肝蛋白質(zhì)的溶解度在等電點(diǎn)(pH值為4.0)時(shí),溶解度最小,這是由于鵝肝蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)呈中性,分子間缺少靜電排斥力,從而造成蛋白質(zhì)沉淀,溶解度降低[30]。當(dāng)pH值呈酸性時(shí)鵝肝蛋白質(zhì)的溶解度先減小后增大,pH值呈堿性時(shí)溶解度逐步升高,并且pH值呈堿性時(shí)的溶解度高于pH值呈酸性時(shí)的溶解度。這是由于超聲處理下,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,形成可溶性蛋白質(zhì)聚集物,蛋白質(zhì)粒徑減小,從而產(chǎn)生增加了蛋白質(zhì)與水的相互作用[31]。與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)的溶解度明顯提高。這與王小英等采用超聲提取大豆分離蛋白質(zhì)的溶解度顯著增加的結(jié)果[32]是一致的。但楊勇等用超聲輔助提取綠豆分離蛋白質(zhì)的結(jié)果[14]顯示,溶解性沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化,這可能是由于超聲處理使綠豆分離蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散的同時(shí)聚集了綠豆分離蛋白質(zhì)。
2.10?鵝肝蛋白質(zhì)的起泡性分析
蛋白質(zhì)起泡性在食品工業(yè)中具有重要作用,在飲料、咖啡等中有著廣泛應(yīng)用[33]。由圖10可知,隨著蛋白質(zhì)濃度的增大,鵝肝蛋白質(zhì)起泡性明顯提高。與常規(guī)水浴提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)的起泡性明顯提高。這與楊勇等采用超聲處理綠豆分離蛋白質(zhì)后起泡性增加[14]是一致的。這可能是由于超聲處理的機(jī)械效應(yīng)和空化作用改變了鵝肝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),暴露出更多的疏水性基團(tuán)和親水性基團(tuán),其表面活性增大,從而減弱了水的表面張力[33]。由圖11可知,隨著蛋白質(zhì)濃度的增加,起泡穩(wěn)定性明顯提高。與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)溶液在濃度為0.1%、1.0% 時(shí),起泡穩(wěn)定性有所上升;當(dāng)鵝肝蛋白質(zhì)溶液濃度為0.5%、2.0%時(shí),起泡穩(wěn)定性有所下降。試驗(yàn)結(jié)果表明,超聲處理能提高蛋白質(zhì)的起泡性,但對(duì)不同濃度鵝肝蛋白質(zhì)起泡穩(wěn)定性的影響程度不同。
2.11?鵝肝蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)分析
蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)在蛋糕、飲料等食品工業(yè)中具有重要作用[34]。由圖12可知,與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性有了明顯提高。這可能是由于通過(guò)超聲處理,導(dǎo)致鵝肝蛋白質(zhì)分子內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,展開(kāi)了部分蛋白質(zhì)分子,其結(jié)構(gòu)更加松散,使得疏水性基團(tuán)具有親水親油性,最終提高了蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)[35],也可能是超聲波產(chǎn)生的瞬時(shí)高溫改變了蛋白質(zhì)的溶解度、粒徑等[34]。畢爽等研究顯示,經(jīng)過(guò)低、中超聲功率超聲處理的黑豆蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性顯著提高[36]。本試驗(yàn)表明,超聲處理能夠提高鵝肝蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性。
3?結(jié)論
SDS-PAGE結(jié)果顯示,超聲處理沒(méi)有改變鵝肝蛋白質(zhì)的亞基組成。超聲處理對(duì)鵝肝蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯影響。圓二色譜及傅里葉紅外光譜結(jié)果表明,超聲處理導(dǎo)致鵝肝蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使其熒光強(qiáng)度顯著降低,蛋白質(zhì)的各二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量發(fā)生變化,主要表現(xiàn)在β-折疊含量顯著下降,α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角含量提高。鵝肝蛋白質(zhì)的熒光光譜及DSC結(jié)果顯示,超聲處理導(dǎo)致鵝肝蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;表面疏水性結(jié)果顯示,超聲處理使鵝肝蛋白質(zhì)伸展,表面疏水性明顯提高。與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)具有較高的溶解性、起泡性、乳化性及乳化穩(wěn)定性等功能特性。超聲輔助提取的鵝肝蛋白質(zhì)與常規(guī)提取的鵝肝蛋白質(zhì)相比,起泡性明顯提高,其起泡穩(wěn)定性的效果根據(jù)鵝肝蛋白質(zhì)溶液的濃度不同有所減弱或提高。
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