杜鵑花F1代群體主要表型性狀及SSR標記的多樣性分析

沈梓力 李美芹 邱甜 吳燕燕 吳月燕 謝曉鴻

摘要：通過性狀的統(tǒng)計分析和開發(fā)的SSR多態(tài)位點的統(tǒng)計分析，篩選以粉紅泡泡（母本）和白鶴（父本）雜交育種產生的F1代的優(yōu)良新品種，以期作為今后開發(fā)推廣的一種新型種質資源。采用表型分析結合SSR分子標記分析的方式，對杜鵑親本及F1代的49份種質的遺傳多樣性進行系統(tǒng)評價和分類分析。表型性狀結果表明，花色的變異系數最大，為54%;葉片絨毛變異系數最小，為25%。表型性狀聚類分析結果表明，親本及F1代聚為7個類群，第1類包含2個個體，第2類包含2個個體，第3類包含4個個體，第4類包含17個個體，第5類包含4個個體，第6類包含9個個體，第7類包含13個個體。分子聚類結果表明，親本及F1代共聚成6個類群，第1類包含13個個體，第2類包含7個個體，第3類包含7個個體，第4類包含8個個體，第5類包含15個個體，第6類包含1個個體。據SSR標記的聚類與表型性狀聚類具有一定的相關性但并不完全一致。

關鍵詞：杜鵑花;表型性狀;SSR標記;種質資源

中圖分類號： S685.210.24文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0177-05

收稿日期：2018-05-27

基金項目：浙江省寧波市重大科技專項（編號：2014C11002）;浙江省“生物工程”重中之重學科學生創(chuàng)新計劃（編號：CX2017012）。

作者簡介：沈梓力（1993—），男，浙江溫州人，碩士研究生，研究方向為食品化學工程與安全控制。E-mail：747643963@qq.com。

通信作者：謝曉鴻，碩士，高級農藝師，研究方向為觀賞植物應用研究。E-mail：285300628@qq.com。

杜鵑花（Rhododendron simsii L.）屬杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron），是我國十大名花之一。我國是杜鵑花的起源地之一，具有豐富的種質資源，但是我國新種質資源的開發(fā)起步較晚，造成我國種質資源相對匱乏的局面[1]。目前，多利用雜交育種的方式選育優(yōu)良植株，這類植株具有觀賞性高的特點，但難以確保基因的多樣性，可能會對進一步的育種工作造成影響。因此，利用表型性狀結合分子標記技術篩選優(yōu)良新種質是杜鵑花選育的有效途徑。表型多樣性的研究主要是通過科學有效地采樣、合理有效的數學統(tǒng)計方法[2]，根據形態(tài)性狀、生理生化性狀等變異較穩(wěn)定的性狀，揭示群體的遺傳規(guī)律和變異大小，客觀評價其遺傳多樣性。目前，許多學者利用表型性狀研究生物多樣性，在甜瓜（Cucumis melo L.）[3]、大蒜（Allium sativum L.）[4]、菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat.）[5]、水稻（Oryza sativa）[6]、獼猴桃（Actinidia spp.）[7]、孔雀草（Tagetes patula L.）[8]、板栗（Castanea mollissima Bl.）[9]等植物中得到了應用?；蚨鄻有澡b定多依據植株基因組的重要作用位點的多樣性進行鑒定，確定植株基因的多樣性。

簡單重復序列（simple sequence sepeat，簡稱SSR）即微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），是廣泛存在于真核和原核生物基因組中1～6個核苷酸基元串聯重復而成的DNA序列[10]，是基于PCR技術建立起來的第2代分子標記技術，該標記主要根據生物中SSR位點的多寡來判斷不同生物個體的基因多樣性，從而判斷物種的多樣性及豐富性，具有多態(tài)性高、共顯性、通用性高、可靠性且重復性高等特點[11]，常用于遺傳連鎖圖譜的構建、遺傳多樣性的檢測、基因定位及分子標記輔助選擇等。

目前，有學者利用表型性狀結合分子標記技術研究生物遺傳多樣性，在五節(jié)芒（Miscanthus floridulus）[12]、棉屬（Gossypium Lin.）[13]、紫薇（Lagerstroemia indica）[14]、杜鵑（Rhododendron L.）[15-16]等植物中均有報道，但利用表型性狀結合SSR標記創(chuàng)制雜交F1代杜鵑花種質資源的研究尚未見報道。開展杜鵑花種質資源創(chuàng)制，對于杜鵑花優(yōu)良種質資源的收集、保存、評價和利用具有重要意義。因此，本研究以白鶴和粉紅泡泡雜交F1代為基礎，結合形態(tài)標記和SSR分析，開展了杜鵑花種質資源的創(chuàng)制研究，旨在為杜鵑花的新種質創(chuàng)制、生產應用以及杜鵑花種質資源的發(fā)展提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

試驗母本白鶴與父本粉紅泡泡于2011年4月進行雜交，2016年9月進行試驗，田間試驗基地為浙江省寧波市北侖萬景杜鵑良種園，從獲得的100株F1代中隨機抽取49株作為試驗材料。

1.2?試驗方法

1.2.1?表型性狀的選取與編碼

收集親本及F1代49株植株的葉片并編號掛牌，對表型性狀進行統(tǒng)計。以杜鵑花數量分類[17]與杜鵑花品種資源和構建分類體系的調查研究[18]為基礎。選取園藝植物的10個性狀進行統(tǒng)計（表1），主要分為株型、分枝特性、枝條顏色、葉片顏色、絨毛特性、葉緣、花冠類型、花冠形狀、花色以及花緣進行性狀統(tǒng)計和測量。

1.2.2?基因組DNA提取

采用改良CTAB法[19]提取基因組DNA，采用BIO-RAD Smart Spec Plus核酸純度儀和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的完整性和純度，根據檢測結果將可用DNA樣品稀釋至50 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3?SSR分析

選用本試驗開發(fā)的10對多態(tài)性SSR引物對親本及F1代49份材料的基因型進行檢測。PCR反應總體系為10 μL，包括1 μL 1×Buffer（含Mg+）、0.8 μL0.2 mmol/L dNTPs、1 μL 0.25 mmol/L上下游引物、0.1 μL0.5 U DNA polymerase以及0.5 μL 50 ng/μL DNA模板，加6.6 μL ddH2O補齊體系。反應在Eppendorf公司生產的Mastercycler普通梯度PCR儀上進行。反應程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。PCR擴增產物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測，EB染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad Gel Doc XR+）成像觀察。

1.3?數據處理與分析

對表型數據進行統(tǒng)計整理后，遺傳距離利用Pearson相關系數進行轉化后表示;統(tǒng)計整理SSR位點信息，利用SPSS 19.0軟件進行聚類分析方法計算并建立表型及基因分類樹狀圖[20]。

2?結果與分析

2.1?主要性狀分析

由表2可知，雜交后代出現了一定程度的遺傳變異，個體間也出現了明顯的性狀差異。其株型、枝條、葉片、花等均出現一定比例的性狀分化，49株子代植株中，質量性狀中植株株型的變異系數為30%;枝條分枝特性變異系數為35%，顏色變異系數為34%;葉片顏色變異系數為35%， 絨毛變異系數為25%，葉緣變異系數為50%;花的變異系數相對較大，花冠類型變異系數為53%，花冠形狀變異系數為41%，花色變異系數為54%，花緣變異系數為35%。

2.2?杜鵑花F1代表型性狀相關性分析

基于遺傳相似系數矩陣，用SPSS 19.0軟件對親本和49份材料進行聚類分析，獲得10個性狀的聚類圖。由圖1可知，F1代表型性狀主要聚為7個類群，第1類包含2個個體，分別為粉紅泡泡和87;第2類包含2個個體，分別為白鶴和6;第3類包含4個個體，分別為白鶴36、64、49和51;第4類包含17個個體，分別為70、79、75、55、65、58、38、63、66、71、25、91、27、19、48、69和86;第5類包含4個個體，分別是21、32、14和31;第6類包含9個個體，分別是46、89、20、44、16、34、15、7和90;第7類包含13個個體，分別是10、50、24、5、52、18、9、22、40、11、35、17和26。在第1類中，87號植株與粉紅泡泡聚為一類;第2類中，6號個體與白鶴聚為一類;第3類中，64號植株花為玫紅色，與其他3個個體存在很大差異，但是在株型上有很大的相似性;第4類中的17個個體中，種質分類最為混亂，發(fā)生花色變異的植株大多聚在這一類，表明該聚類種質性狀復雜，極有可能發(fā)生一定程度的變異，因此可以作為新種質資源選育的分類點;第5類中，花型和花色均有一定程度的變異，可作為候選新種質的類別;第6類聚類中，植株從屬性和花色屬性上都與母本白鶴相似，發(fā)生了極少量的變異，因此不宜作為新種質的開發(fā)類別;第7類中花屬性發(fā)生了變異，可作為候選新種質的類別。

2.3?SSR標記的多態(tài)性

利用試驗開發(fā)的10個標記對49個后代及親本進行多態(tài)性篩選，共擴增出23條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶數為2～4個（表3）。

2.4?雜交F1代聚類分析

通過UPGMA進行聚類分析表明，親本和F1代49份種質共聚成6個類群，第1類包含13個個體，分別為63、64、66、86、5、9、11、87、粉紅泡泡、24、32、46和48;第2類包含7個個體，分別為34、71、19、7、31、14和75;第3類包含7個個體，分別為58、69、10、27、50、44和65;第4類包含8個個體，分別為9、白鶴、16、35、51、22、40和70;第5類包含15個個體，分別為79、89、26、21、18、25、38、52、90、15、17、20、36、49和91;第6類包含1個個體，為55號（圖2）。

以質量性狀為基礎，結合Pearson相關系數的聚類結果和SSR分子標記聚類結果，選取觀賞價值高且遺傳多樣性高的品種作為候選種質。55號種質花冠類型為單瓣，花冠形狀為碟型，花色為粉色，花緣為波狀，綜合了親本的生物學性狀且出現了一定程度的變異，基于Pearson相關系數的聚類結果顯示55號種質聚到第4類，基于SSR分子標記的聚類聚到第6類，表明55號雜交種質具有較高的性狀差異和遺傳差異。64號雜交種質花冠類型為重瓣，花冠形狀為碟型，花色為玫紅色，花緣為波狀，在花冠類型和花色方面出現了一定程度的變異，基于Pearson相關系數的聚類聚到第3類，與親本白鶴聚為一類，基于SSR分子標記的聚類聚到第1類，與親本粉紅泡泡聚為一類，表明64號雜交種質是親本植株的雜交種質，變異系數相對較小，但觀賞性狀相對較高。因此，具有較高的觀賞性狀和一定遺傳差異的55號和64號雜交種適合作為候選新品種。經過表現型的觀察和對比親本表現型與F1代49份種質，發(fā)現55號（圖3）、64號新種質（圖4）。這2種新種質的性狀穩(wěn)定且遺傳性優(yōu)良，因此可以將這2種新種質從中挑選出來，作為新品種進行推廣。

3?討論與結論

目前，許多學者利用表型性狀的改變來衡量植株變異[21-24]，但是表型變異需要長期的積累過程才能逐步形成，難以及時反饋生物的變異信息，且是基因和環(huán)境因子共同作用的結果。因此，利用表型性狀結合分子標記對生物變異進行統(tǒng)計分析，是衡量生物變異及基因多樣性的一個重要手段[25]。分子標記聚類具有更高的靈敏度。利用分子標記技術研究杜鵑花種質的遺傳多樣性，可以不受環(huán)境、發(fā)育時期和器官等的限制，從基因組水平上揭示其遺傳變異的程度，且在早期就可進行新品種的鑒定[26]。

在杜鵑花實際生產過程中，優(yōu)良種質資源大多根據表型性狀進行篩選，在生產過程中會造成選育失敗以及種質的性狀不穩(wěn)定的現象。在實際生產過程中，利用更為科學的手段進行種質資源的選育成為解決新種質選育所面臨問題的關鍵。因此，利用分子標記技術結合表型性狀的差異進行選育是相對更為科學的選育體系。這為杜鵑花的選育工作提供了更為科學的依據。

本研究對F1代49份種質以及親本的10個表型性狀的聚類分析研究表明，供試材料的表型性狀相似程度高的樣本聚為一類，通過此表型聚類結果可知，利用Person相關系數進行表型聚類具有極高的應用價值。表型聚類結合分子標記聚類分析結果表明，兩者聚類結果不完全一致，具有一定的差異。這可能是因為所選SSR位點的覆蓋率以及SSR位點的作用位點的不同而具有一定的差異。但是通過表型聚類結合分子聚類對生物變異進行分析，具有更高的應用價值以及現實意義。

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