歐洲溫室型黃瓜同源四倍體新種質(zhì)的創(chuàng)制與鑒定

武婭歌 趙建華 宋曉飛 李曉麗 孫成振 閆立英 鄭金雙

摘要：為構(gòu)建黃瓜同源四倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系，創(chuàng)制新種質(zhì)，以3個(gè)秋水仙素濃度（0.1、0.2、0.3 g/L）3個(gè)處理次數(shù)（3、5、7次）對(duì)二倍體歐洲溫室型黃瓜（2n=2x=14）幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行處理，通過(guò)植株形態(tài)鑒定與氣孔鑒定、DNA相對(duì)含量鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定等方法，篩選誘變植株并鑒定倍性。研究發(fā)現(xiàn)，以2、3 g/L秋水仙素處理5次誘導(dǎo)效果較好，獲得了歐洲溫室型黃瓜同源四倍體（2n=4x=28）和非整倍體（2n=4x=26）。與二倍體親本相比，同源四倍體黃瓜子葉大小、葉片大小、主莖粗、雌雄花大小、保衛(wèi)細(xì)胞大小和保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉單位面積綠體數(shù)目等均呈極顯著增加，但氣孔密度極顯著減少。本研究獲得了歐洲溫室型黃瓜同源多倍體新種質(zhì)，為黃瓜種質(zhì)創(chuàng)新與歐洲溫室型新品種選育奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：歐洲溫室型黃瓜;秋水仙素;多倍體;二倍體;同源四倍體;氣孔;細(xì)胞學(xué);誘導(dǎo)效果;形態(tài)特征

中圖分類號(hào)：S642.202.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）18-0141-05

收稿日期：2018-06-08

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金（編號(hào)：C2015407058）。

作者簡(jiǎn)介：武婭歌（1993—），女，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟俗魑镉N。E-mail：969361514@qq.com。

通信作者：鄭金雙，博士，講師，研究方向?yàn)槭卟俗魑?、藥用植物栽培和育種。E-mail：jinshuangk@163.com。

黃瓜（Cucumissativus L.）為葫蘆科甜瓜屬植物，原產(chǎn)于喜馬拉雅山南麓的熱帶雨林地區(qū)和中國(guó)的云南地區(qū)，是世界上主要的蔬菜作物之一，也是設(shè)施栽培的主要蔬菜作物[1]。不同區(qū)域喜好不同，主栽品種和類型也不同，果實(shí)形態(tài)、口感差異較大。歐洲溫室型黃瓜以無(wú)刺、色深綠、肉質(zhì)軟、味甜等特點(diǎn)，成為重要的鮮食“水果型”黃瓜。目前，黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，我國(guó)黃瓜育種材料的親緣關(guān)系過(guò)于單一，遺傳育種研究相對(duì)落后[2]。

多倍體因其“巨大性”，能顯著提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，增強(qiáng)植物的抗病、抗逆能力[3-4]。多倍體育種已廣泛應(yīng)用在糧食作物[5]、果蔬作物[6-8]、觀賞植物[9-11]以及藥用植物[12-14]的育種工作中。

目前，黃瓜多倍體育種方面的研究已經(jīng)開(kāi)展。陳勁楓等利用秋水仙素溶液處理萌動(dòng)種子，獲得了華北型黃瓜同源四倍體[6]。刁衛(wèi)平等采用離體誘導(dǎo)未授粉子房的方法，獲得了華北型黃瓜同源四倍體[15]。鄢郁霖等利用秋水仙素處理干種子和已露出0.5～1.0 cm胚根的萌動(dòng)種子，獲得了露地型黃瓜同源四倍體[16]。劉永月等利用秋水仙素和二甲基亞砜混合液處理萌動(dòng)種子，獲得了華北型無(wú)毛黃瓜同源四倍體[17]。但關(guān)于歐洲溫室型黃瓜多倍體的研究報(bào)道較少。本研究采用不同濃度和不同處理次數(shù)對(duì)歐洲溫室型黃瓜幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，旨在建立秋水仙素誘導(dǎo)黃瓜幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)技術(shù)體系及其倍性鑒定體系，創(chuàng)造同源四倍體新種質(zhì)，豐富黃瓜種質(zhì)資源，為歐洲溫室型黃瓜新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組陳勁楓教授提供的歐洲溫室型黃瓜‘南水3號(hào)種子為試驗(yàn)材料。

1.2?多倍體誘導(dǎo)

2015年秋，種子溫燙浸種后播于50孔穴盤中，置于日光溫室內(nèi)育苗。2張子葉完全展開(kāi)后，將棉球置于生長(zhǎng)點(diǎn)，用膠頭滴管吸取秋水仙素溶液，滴于生長(zhǎng)點(diǎn)棉球上，完全浸濕棉球。于07：00—08：00和17：00—18：00進(jìn)行0.1、0.2、0.3 g/L 3個(gè)秋水仙素濃度處理，3個(gè)處理次數(shù)為3、5、7次，共9個(gè)處理，以蒸餾水處理為對(duì)照，每個(gè)處理100株。處理結(jié)束后，棄去棉球。

1.3?多倍體植株的鑒定

1.3.1?植株形態(tài)鑒定與氣孔鑒定

形態(tài)鑒定：于同一時(shí)間觀測(cè)對(duì)照與處理植株的高度、葉片形態(tài)，進(jìn)行變異植株初步的形態(tài)鑒定。

氣孔鑒定：取完全展開(kāi)的葉片，撕取下表皮，利用顯微鏡觀察氣孔的大小、氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量，進(jìn)行氣孔鑒定。每個(gè)植株選取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)（20倍視野下）氣孔密度，每個(gè)視野隨機(jī)選1個(gè)氣孔測(cè)量氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度。

1.3.2?DNA相對(duì)含量鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定

通過(guò)形態(tài)鑒定和氣孔鑒定，對(duì)篩選出的候選變異植株進(jìn)行自交留種。2016年春播種，對(duì)T1代植株進(jìn)行DNA相對(duì)含量鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定。

DNA相對(duì)含量鑒定：取對(duì)照和候選變異植株生長(zhǎng)點(diǎn)幼嫩葉片，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA相對(duì)含量鑒定。

細(xì)胞學(xué)鑒定：根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，對(duì)DNA相對(duì)含量變化的植株進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，進(jìn)一步鑒定倍性。于晴天07：00—08：00取長(zhǎng)度約1 mm的幼嫩雄花，于卡諾固定液（無(wú)水乙醇 ∶冰乙酸3 ∶1）中固定24 h，蒸餾水洗滌3次，75%乙醇中保存。采用常規(guī)壓片制片法[18]，利用光學(xué)顯微鏡觀察花藥絨氈層體細(xì)胞染色體數(shù)量，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。每個(gè)植株統(tǒng)計(jì)20個(gè)細(xì)胞，以加倍染色體數(shù)量所占比例高于85%作為同源四倍體純合體的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)秋水仙素處理后成苗株數(shù)計(jì)算死亡率，根據(jù)上述鑒定方法鑒定獲得的同源四倍體株數(shù)計(jì)算誘導(dǎo)率。

死亡率=死亡的幼苗數(shù)/總數(shù)×100%;

誘導(dǎo)率=產(chǎn)生變異的幼苗數(shù)/總數(shù)×100%。

1.4?二倍體與同源四倍體歐洲溫室型黃瓜比較

對(duì)鑒定為同源四倍體的歐洲溫室型黃瓜植株進(jìn)行自交留種，2017年春對(duì)T3代植株進(jìn)行二倍體與同源四倍體植株形態(tài)、顯微特征與果實(shí)品質(zhì)比較。

1.4.1?二倍體與同源四倍體歐洲溫室型黃瓜植株形態(tài)特征比較

營(yíng)養(yǎng)器官：于子葉期和結(jié)果期分別測(cè)量二倍體與變異植株的形態(tài)特征，子葉期測(cè)定子葉長(zhǎng)、子葉寬、子葉節(jié)長(zhǎng)、子葉節(jié)粗，結(jié)果期測(cè)定植株的高度、中部的葉片長(zhǎng)與葉片寬、主蔓節(jié)間長(zhǎng)、主蔓節(jié)間粗、葉柄長(zhǎng)、葉柄粗。

生殖器官：取當(dāng)天開(kāi)放的雌花和雄花進(jìn)行拍照，分割雌花與子房，比較二倍體和同源四倍體雌雄花和子房大小。

1.4.2?二倍體與同源四倍體歐洲溫室型黃瓜顯微特征比較

氣孔特征比較采用的方法同“1.3.1”氣孔鑒定。取0.5 mm 左右大小的雄花，用卡諾固定液（無(wú)水乙醇 ∶冰乙酸=3 ∶1）固定24 h，75%乙醇保存。采用常規(guī)壓片制片法，利用光學(xué)顯微鏡觀察花粉粒形態(tài)。取當(dāng)天開(kāi)放雄花，利用KYKY-2800掃描電子顯微鏡觀察二倍體與同源四倍體的花粉粒形態(tài)。

1.4.3?二倍體與同源四倍體歐洲溫室型黃瓜果實(shí)特征比較

取二倍體與同源四倍體商品瓜，測(cè)定商品瓜果實(shí)形態(tài)特征（瓜長(zhǎng)、瓜橫徑、瓜把長(zhǎng)、中心腔、果肉厚）、含水量和含糖量。

1.5?數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excle 2010，數(shù)據(jù)分析采用DPS 14.50。

2?結(jié)果與分析

2.1?秋水仙素對(duì)歐洲溫室型黃瓜的誘導(dǎo)效果

由表1可知，隨著秋水仙素處理濃度的增加和次數(shù)的延長(zhǎng)，死亡率呈增加趨勢(shì)。0.1 g/L秋水仙素處理時(shí)，黃瓜幼苗死亡率相對(duì)最低，變異率為0.00。0.3 g/L 秋水仙素處理時(shí)，隨著處理次數(shù)的增加，對(duì)生長(zhǎng)點(diǎn)毒害作用增強(qiáng)，黃瓜幼苗死亡率相對(duì)較高，處理7次時(shí)死亡率達(dá)到92.73%。綜合誘導(dǎo)率和死亡率，以0.2、0.3 g/L秋水仙素處理5次誘導(dǎo)效果較佳。

2.2?多倍體黃瓜植株的獲得

2.2.1?植株形態(tài)鑒定與氣孔鑒定

根據(jù)植株形態(tài)進(jìn)行變異植株初步篩選，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，各處理組黃瓜植株高度、生長(zhǎng)速度、葉片大小和形態(tài)均出現(xiàn)不同程度的變異現(xiàn)象，如植株矮小、葉色變深、葉片褶皺等（圖1-A和1-B）。

氣孔的巨大性是多倍體植株在解剖水平的重要表現(xiàn)，也是初步篩選和鑒定多倍體的重要標(biāo)準(zhǔn)。篩選出氣孔面積明顯增大、氣孔密度減少的候選變異植株（圖1-C和1-D），并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2.2.2?DNA相對(duì)含量鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定

利用流式細(xì)胞儀對(duì)候選變異植株進(jìn)行進(jìn)一步倍性確定。研究發(fā)現(xiàn)，二倍體歐洲溫室型黃瓜相對(duì)熒光強(qiáng)度為50（圖2-A），候選變異植株的相對(duì)熒光強(qiáng)度為100（圖2-B）、75（圖2-C）等。

采用常規(guī)染色體壓片、染色體計(jì)數(shù)技術(shù)，對(duì)變異植株染色體數(shù)目進(jìn)行進(jìn)一步確定。結(jié)果表明，二倍體黃瓜染色體為2n=2x=14（圖2-D），變異植株染色體為2n=4x=28（圖2-E）、2n=4x=26（圖2-F）。經(jīng)鑒定，共獲得歐洲溫室型黃瓜同源四倍體新種質(zhì)4個(gè)、非整倍體新種質(zhì)1個(gè)。

2.3?二倍體與同源四倍體歐洲溫室型黃瓜比較

2.3.1?植株形態(tài)比較

二倍體與同源四倍體黃瓜差異顯著性分析表明，子葉節(jié)長(zhǎng)和株高達(dá)到極顯著差異，子葉節(jié)粗差異顯著（表2）。與二倍體相比，同源四倍體黃瓜的子葉大小、葉片大小呈極顯著增大，此外，同源四倍體黃瓜的葉片顏色加深、葉片厚度增加、葉片表面褶皺。

同源四倍體黃瓜與二倍體相比，除雌花子房長(zhǎng)差異不顯著外，雄花和雌花花冠大小、花瓣大小均明顯增大，花期子房直徑和果柄長(zhǎng)均達(dá)到極顯著差異，且花冠褶皺程度高（表3、圖3）。

2.3.2?顯微特征比較

由表4可知，與二倍體相比，同源四倍體歐洲溫室型黃瓜葉片下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積葉綠體數(shù)量均呈現(xiàn)極顯著增加，分別為二倍體的1.52、203倍;氣孔密度極顯著減少，為二倍體的0.34倍。二倍體黃瓜花粉為三孔型（圖4-A和4-C），同源四倍體花粉除正常三孔型外，還出現(xiàn)四孔型、五孔型花粉（圖4-B、4-D和4-E），且敗育花粉比率較高，達(dá)70%以上（圖4-F）。

2.3.3?果實(shí)形態(tài)與品質(zhì)比較

在果實(shí)形態(tài)與品質(zhì)特征方面，與二倍體親本相比，同源四倍體黃瓜果實(shí)長(zhǎng)度、直徑、中心腔直徑、果肉厚、瓜把長(zhǎng)等均較小，但含糖量顯著提高（表5）。

3?討論與結(jié)論

人工誘導(dǎo)多倍體是植物育種的一個(gè)重要手段，也是創(chuàng)制新種質(zhì)的重要途徑。陳勁楓等對(duì)采用不同濃度秋水仙素溶液浸泡干種子的方法獲得黃瓜同源四倍體，發(fā)現(xiàn)4 g/L秋水仙素浸萌動(dòng)種子4 h的染色體加倍率可達(dá)26.7%[6]。本研究采用秋水仙素處理幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)的方法，發(fā)現(xiàn)以2、3 g/L 秋水仙素處理5次誘導(dǎo)效果較好。低濃度處理次數(shù)較少時(shí)，成苗率較高，而在較高濃度處理次數(shù)較多時(shí)，成苗率降低，這與孔素萍等的研究結(jié)果[19]相一致。在本研究中，黃瓜幼苗的死亡率與秋水仙素處理時(shí)間和濃度呈正相關(guān)。

二倍體與同源四倍體植株在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方面均存在較大差異，研究表明，同源四倍體植株葉片氣孔大小、花粉粒大小、雌雄花大小、葉片大小與厚度、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量等均高于二倍體親本，而植株高度、氣孔密度均低于二倍體親本[13，20]。本研究中二倍體親本黃瓜通過(guò)秋水仙素誘變后，在形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方面均表現(xiàn)出不同程度的畸形現(xiàn)象。首先利用誘變植株的形態(tài)學(xué)特征、氣孔特征進(jìn)行變異植株初步篩選，再對(duì)候選植株進(jìn)行DNA相對(duì)含量和染色體數(shù)目鑒定確定其倍性水平，極大程度提高了多倍體植株篩選的工作效率。

多倍體雄花和花粉直徑均大于二倍體，而且花粉形態(tài)異常，萌發(fā)率低[21]，多倍化容易導(dǎo)致植物育性降低[22-24]。陳勁楓等發(fā)現(xiàn)，四倍體花粉粒大小不一，每一朵花中平均有2.3%的4孔花粉粒[6]。Diao等發(fā)現(xiàn)，四倍體植株自交后代在細(xì)胞遺傳水平上較穩(wěn)定，但二倍體與同源四倍體黃瓜育性上存在較大差異[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，變異植株花粉出現(xiàn)四孔型、五孔型等形態(tài)變異類型，且同源四倍體黃瓜花粉有較高比率的敗育現(xiàn)象，可能是導(dǎo)致自交授粉后單瓜結(jié)籽率低的主要原因。本研究為黃瓜遺傳育種提供了新種質(zhì)，為雙子葉植物多倍體育種提供了技術(shù)支持。

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