天然有機(jī)物添加對(duì)金釵石斛快繁的影響

李曉君 潘繼軍 曹琦 普婭

摘要：為研究蘭科植物組織培養(yǎng)常用有機(jī)添加物香蕉和馬鈴薯對(duì)金釵石斛快繁的影響，以云南臨滄野生金釵石斛蒴果為材料，比較金釵石斛在添加不同類型或不同濃度添加物的種胚萌發(fā)培養(yǎng)基、原球莖分化培養(yǎng)基、幼苗擴(kuò)繁培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加馬鈴薯汁和香蕉汁均可促進(jìn)金釵石斛種胚萌發(fā)和原球莖形成，最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+馬鈴薯汁30 mL/L+3%蔗糖;MS+馬鈴薯汁40～60 mL/L+3%蔗糖適于金釵石斛原球莖分化成苗培養(yǎng)，在MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁60～80 mL/L+3%蔗糖條件下幼苗的擴(kuò)繁系數(shù)為4.8～5.1;MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60～100 mL/L+3%蔗糖可用于金釵石斛生根培養(yǎng)。在金釵石斛組培快繁過(guò)程中，添加馬鈴薯汁可促進(jìn)金釵石斛的種胚萌發(fā)、幼苗分化和擴(kuò)繁，添加一定濃度的香蕉汁對(duì)金釵石斛生根具有較好的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：金釵石斛;香蕉汁;馬鈴薯汁;培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)： S567.23+9.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）18-0079-04

收稿日期：2018-05-29

基金項(xiàng)目：滇西科技師范學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：LXJ2012）;云南省科技廳青年項(xiàng)目（編號(hào)：2017FD249）。

作者簡(jiǎn)介：李曉君（1985—），女，云南臨滄人，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新，E-mail：lxj-148@163.com。

金釵石斛（Dendrobium nobile）別稱石斛，是主要的藥用石斛之一[1]。金釵石斛的化學(xué)成分主要包括生物堿、倍半萜、聯(lián)芐、芴酮、酚酸、苯丙素、菲、多糖等，具有抗腫瘤、降血糖、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)胃液分泌、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[2-4]。金釵石斛花朵優(yōu)美，具有較高的觀賞價(jià)值。金釵石斛可采用扦插、分株、壓條等方法進(jìn)行繁殖，但由于生產(chǎn)效率較低，生產(chǎn)上金釵石斛的繁殖以組織培養(yǎng)（組培）為主，外植體材料可選擇莖段，也可用蒴果，蒴果因消毒容易，幼苗生成量大，在生產(chǎn)上經(jīng)常被采用[1，5-6]。研究表明，向培養(yǎng)基中添加天然有機(jī)物可促進(jìn)組培石斛苗的生長(zhǎng)，其中添加馬鈴薯汁和香蕉汁對(duì)金釵石斛的快繁具有促進(jìn)作用，但各研究報(bào)道的添加方法和添加量不一[6-11]。本研究以MS為基本培養(yǎng)基，在金釵石斛組織培養(yǎng)的不同生長(zhǎng)階段添加不同濃度的香蕉汁或馬鈴薯汁，揭示香蕉汁或馬鈴薯汁添加濃度對(duì)金釵石斛各階段組培苗生長(zhǎng)的影響，找出合適的濃度添加范圍，以期為金釵石斛種苗生產(chǎn)提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料及消毒方法

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）種植于滇西科技師范學(xué)院大棚[12]，于2016年4月對(duì)開(kāi)花植株進(jìn)行人工異花授粉，2016年11月收集蒴果進(jìn)行培養(yǎng)。消毒方法：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將金釵石斛蒴果用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗4次，將消毒后的果實(shí)置于滅菌的培養(yǎng)皿中，用解剖刀沿中心線縱切，用鑷子夾住其中1/2，小心將種子均勻播撒于胚萌發(fā)培養(yǎng)基中。

1.2?相關(guān)試劑

香蕉汁：取黃熟香蕉，切成0.5 cm左右小丁，按照香蕉 ∶蒸餾水為1 g ∶1.5 mL的比例加蒸餾水煮沸后，小火煮至香蕉軟爛，用紗布將上清濾出，用蒸餾水定容至濃度為1 g/mL，備用。馬鈴薯汁：取未長(zhǎng)芽的馬鈴薯，切成細(xì)絲，按照馬鈴薯 ∶蒸餾水為1 g ∶1.5 mL的比例加蒸餾水煮沸后，小火煮至馬鈴薯軟爛，用紗布將上清濾出，用蒸餾水定容至濃度為1 g/mL，備用。試劑：MS基本培養(yǎng)基相關(guān)藥品為國(guó)產(chǎn)分析純，6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）[13]和萘乙酸（NAA）由Sigma-Aldrich 公司提供。

1.3?金釵石斛各階段培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1?種胚萌發(fā)培養(yǎng)基

1-a：MS;1-b：MS+香蕉汁10 mL/L;1-c：MS+香蕉汁20 mL/L;1-d：MS+香蕉汁30 mL/L;1-e：MS+馬鈴薯汁10 mL/L;1-f：MS+馬鈴薯汁20 mL/L;1-g：MS+馬鈴薯汁30 mL/L。

該培養(yǎng)基添加蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.7%，pH值調(diào)整至5.8，每個(gè)培養(yǎng)基接種5瓶以上，接種后置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，周期性培養(yǎng)條件：光照培養(yǎng)溫度為26 ℃，光照度為1 000 lx，培養(yǎng)時(shí)間為14 h;暗培養(yǎng)溫度為24 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 h，培養(yǎng)2個(gè)月后進(jìn)行萌發(fā)情況以及原球莖質(zhì)量比較分析。

1.3.2?原球莖分化培養(yǎng)基

2-a：MS;2-b：MS+馬鈴薯汁20 mL/L;2-c：MS+馬鈴薯汁40 mL/L;2-d：MS+馬鈴薯汁60 mL/L。

該培養(yǎng)基添加蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.7%，pH值調(diào)整至5.8，選擇萌發(fā)情況最佳的原球莖，轉(zhuǎn)入該培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種5瓶以上，接種后于置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，周期性培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)溫度為26 ℃，光照度2 000 lx，培養(yǎng)時(shí)間為14 h;暗培養(yǎng)溫度為24 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。培養(yǎng)2個(gè)月后進(jìn)行幼苗生長(zhǎng)情況比較。

1.3.3?幼苗擴(kuò)繁培養(yǎng)基

3-a：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L;3-b：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁20 mL/L;3-c：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁40 mL/L;3-d：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁60 mL/L;3-e：MS+6-BA 1 mg/L+NAA0.2 mg/L+ 馬鈴薯汁80 mL/L;3-f：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁100 mL/L。

該培養(yǎng)基添加蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.7%，pH調(diào)整至為5.8，每種培養(yǎng)基接種5瓶以上，接種時(shí)標(biāo)記每瓶接種苗數(shù)。培養(yǎng)條件同種胚萌發(fā)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2個(gè)月后進(jìn)行擴(kuò)繁系數(shù)比較。擴(kuò)繁系數(shù)統(tǒng)計(jì)：每個(gè)處理隨機(jī)選取3瓶進(jìn)行株數(shù)統(tǒng)計(jì)，擴(kuò)繁系數(shù)=擴(kuò)繁后瓶苗數(shù)/接種時(shí)苗數(shù);株高測(cè)量：每個(gè)處理隨機(jī)選3瓶，每瓶選取5株測(cè)量株高。

1.3.4?生根培養(yǎng)基

選取擴(kuò)繁系數(shù)高、質(zhì)量好的瓶苗作為培養(yǎng)材料，接入以下生根培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種不少于5瓶，4-a：MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L;4-b：MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁40 mL/L;4-c：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60 mL/L;4-d：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁80 mL/L;4-e：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁100 mL/L;4-f：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁120 mL/L。

該培養(yǎng)基添加蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為7%，pH值調(diào)整至為5.8，培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)溫度為26 ℃，光照度為2 000 lx，培養(yǎng)時(shí)間為14 h;暗培養(yǎng)溫度為24 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。培養(yǎng)2個(gè)月后進(jìn)行幼苗及根系生長(zhǎng)情況比較。根量計(jì)數(shù)：每個(gè)處理選3瓶，每瓶隨機(jī)測(cè)3叢苗根量;根長(zhǎng)測(cè)量：每個(gè)處理選3瓶，每瓶隨機(jī)測(cè)10根根長(zhǎng);株高測(cè)量：每個(gè)處理隨機(jī)選3瓶，每瓶選取5株測(cè)量株高;叢苗數(shù)統(tǒng)計(jì)：每個(gè)處理隨機(jī)選3瓶，每瓶隨機(jī)選5叢苗計(jì)數(shù)。

1.4?統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行處理分析，采用LSD法進(jìn)行差異顯著性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?香蕉或馬鈴薯汁及濃度對(duì)金釵石斛種胚萌發(fā)的影響

金釵石斛種胚播于種胚萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月后，萌發(fā)情況見(jiàn)圖1，萌發(fā)率及原球莖形態(tài)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。除了對(duì)照1-a外，種胚在各培養(yǎng)基的萌發(fā)率均達(dá)到20%以上，隨著有機(jī)添加物濃度的升高，萌發(fā)效果變好，在添加馬鈴薯汁的培養(yǎng)基中萌發(fā)率均較添加同等濃度香蕉汁高，原球莖較為飽滿，緊密，在添加香蕉汁的培養(yǎng)基中，原球莖頂部幼葉較為開(kāi)展，原球莖間疏松易于分離，添加馬鈴薯汁的培養(yǎng)基中原球莖幼葉較為緊湊。結(jié)果說(shuō)明，添加香蕉和馬鈴薯汁均對(duì)金釵石斛種胚萌發(fā)具有促進(jìn)作用，在添加香蕉汁的培養(yǎng)基中，底部的種胚愈傷化成黃色，無(wú)法形成正常原球莖，可見(jiàn)添加馬鈴薯汁較有利于種胚萌發(fā)和早期原球莖的生長(zhǎng)。生產(chǎn)上金釵石斛胚萌發(fā)培養(yǎng)基推薦使用MS+馬鈴薯汁30 mL/L+3%蔗糖。

2.2?馬鈴薯汁添加量對(duì)金釵石斛原球莖分化的影響

選取1-g處理的金釵石斛原球莖轉(zhuǎn)入原球莖分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2個(gè)月后，進(jìn)行幼苗分化情況比較，結(jié)果見(jiàn)圖2，在未添加馬鈴薯汁的MS培養(yǎng)基中，金釵石斛幼苗較黃，基部愈傷化明顯，大部分原球莖分化不完全，未形成完整幼苗;在添加馬鈴薯汁的3個(gè)處理中，小苗分化較完整，基部無(wú)愈傷組織，原球莖分化率相近，小苗濃綠，相比2-b處理，2-c處理、2-d 處理的幼苗基部幼莖較粗壯，說(shuō)明添加馬鈴薯汁對(duì)金釵石斛原球莖分化成幼苗具有促進(jìn)作用，MS+馬鈴薯汁40～60 mL/L+3%蔗糖配方可用于金釵石斛原球莖分化成苗培養(yǎng)。

2.3?馬鈴薯汁添加量對(duì)金釵石斛擴(kuò)繁的影響

選取處理2-d中的金釵石斛幼苗為材料，轉(zhuǎn)入擴(kuò)繁培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)2個(gè)月后，進(jìn)行擴(kuò)繁系數(shù)和幼苗生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2，可以看出，添加馬鈴薯汁對(duì)金釵石斛增殖和生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，其中對(duì)擴(kuò)繁系數(shù)的影響達(dá)到顯著差異水平，馬鈴薯添加量達(dá)100 mL/L時(shí)，擴(kuò)繁系數(shù)開(kāi)始下降，添加量達(dá)80 mL/L時(shí)，苗高開(kāi)始下降。在MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+馬鈴薯汁60～80 mL/L培養(yǎng)基中，擴(kuò)繁系數(shù)達(dá)5.0左右，苗高為3.5 cm左右，可作為生產(chǎn)用幼苗擴(kuò)繁培養(yǎng)基。

2.4?香蕉汁添加量對(duì)金釵石斛生根培養(yǎng)的影響

選取處理3-d中的幼苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種2個(gè)月后進(jìn)行生根量、根長(zhǎng)、株高和叢苗數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（表3）表明，在添加香蕉汁的各處理中金釵石斛的生根量、根長(zhǎng)和叢苗數(shù)都與未添加香蕉汁的4-a處理呈顯著差異，從整體趨勢(shì)來(lái)看，在40～100 mL/L范圍內(nèi)，香蕉汁添加量與根量、根長(zhǎng)呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)香蕉汁添加量達(dá)120 mL/L時(shí)，金釵石斛株高顯著下降，香蕉提取物可溶性糖類豐富，株高下降可能與培養(yǎng)基滲透壓過(guò)高有關(guān)。MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60～100 mL/L培養(yǎng)基可用于金釵石斛生根培養(yǎng)，組培苗質(zhì)量符合1級(jí)苗標(biāo)準(zhǔn)[5]。

圖3為本研究所選用的材料及各階段在最佳培養(yǎng)基中培養(yǎng)下的金釵石斛幼苗。

3?結(jié)論與討論

蔣波等發(fā)現(xiàn)，在以莖段為材料誘導(dǎo)金釵石斛擴(kuò)繁過(guò)程中，添加10%的椰子汁有利于金釵石斛原球莖增殖，而10%的香蕉汁則有利于原球莖分化[6]。唐德英等認(rèn)為，在萌芽、增殖和成苗階段均應(yīng)選擇馬鈴薯汁為添加物，濃度為200 g/L，在生根階段應(yīng)選用香蕉為添加物，添加量為150 g/L[7]。鄭建鈴研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛在分別添加70 g/L馬鈴薯泥和香蕉泥的1/2 MS培養(yǎng)基中萌發(fā)效果較好，其中添加70 g/L馬鈴薯泥的1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)原球莖成苗效果較好，添加70 g/L香蕉泥的1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)幼苗的生根效果較佳[8]。羅林會(huì)等在金釵石斛快繁體系的原球莖誘導(dǎo)增殖和分化階段均添加2%的馬鈴薯汁，生根階段添加2%濃度的馬鈴薯漿和香蕉汁，可以取得較好的效果[9]。徐德林等研究發(fā)現(xiàn)， 在金釵石斛種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，添加10 g/L的馬鈴薯有利于種子萌發(fā)[10]。陳庭等在增殖培養(yǎng)基中添加20 g/L香蕉汁，取得了756.74%的類原球莖增殖質(zhì)量率[11]。也有部分金釵石斛組織培養(yǎng)研究未添加任何天然有機(jī)物，而側(cè)重于激素配比研究。如楊瀾等在金釵石斛叢生芽誘導(dǎo)和增殖研究中，均未添加天然有機(jī)物[14-16]。目前尚未有專門針對(duì)金釵石斛組織培養(yǎng)中有機(jī)物及其添加量的研究報(bào)道，馬鈴薯和香蕉均為易于獲取的天然有機(jī)添加物，其價(jià)格低廉，適用于生產(chǎn)。大部分研究添加馬鈴薯和香蕉時(shí)未過(guò)濾，直接做成泥進(jìn)行添加，本研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯泥和香蕉泥不溶部分在制備培養(yǎng)基時(shí)容易沉淀于培養(yǎng)基底部，在分裝時(shí)常常造成不溶性物質(zhì)分裝不勻，進(jìn)而造成試驗(yàn)誤差，因此在試驗(yàn)方法中特別提出對(duì)二者的提取物進(jìn)行過(guò)濾。本研究結(jié)合已有研究結(jié)果，在常規(guī)石斛及蘭科組織培養(yǎng)激素配比基礎(chǔ)上[17-18]，進(jìn)行了馬鈴薯汁和香蕉汁添加和添加量的探討，從種胚到生根培養(yǎng)，獲得了較佳的有機(jī)物添加方案，可為后續(xù)金釵石斛大規(guī)模生產(chǎn)中的有機(jī)物添加提供參考。

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