超低溫冷凍技術(shù)應(yīng)用于魚(yú)精子保存的研究進(jìn)展

李景春 柯文杰 楊虹 于輝 楊映

摘要：介紹了超低溫的發(fā)展歷程、目前所取得的成果和優(yōu)勢(shì)所在，回顧了我國(guó)漁業(yè)生產(chǎn)中魚(yú)精子的超低溫的應(yīng)用，及未來(lái)市場(chǎng)的發(fā)展前景。分析了該技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中影響結(jié)果的因素，稀釋劑、抗凍劑、凍融方法在操作過(guò)程中的原理原則和注意事項(xiàng)，以及目前解決超低溫過(guò)程中產(chǎn)生問(wèn)題所能采取的方法措施，總結(jié)了超低溫目前存在的缺陷和未來(lái)需要發(fā)展的方向，有益于超低溫冷凍在漁業(yè)領(lǐng)域大面積的推廣及應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：超低溫冷凍;魚(yú)精子;玻璃化;稀釋液;抗凍劑;漁業(yè)

中圖分類(lèi)號(hào)： S961.2+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）18-0066-04

收稿日期：2019-06-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)：2018ZX08010-08B）;廣東省動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[編號(hào)：（2019）75號(hào)]。

作者簡(jiǎn)介：李景春（1989—），男，廣東湛江人，碩士研究生，主要從事魚(yú)精子超低溫冷凍方向的研究。E-mail：lijingchun1124@126.com。

通信作者：楊?映，博士，副教授，主要從事魚(yú)精子超低溫冷凍技術(shù)的研究。E-mail：4161341613@163.com。

隨著科技高速發(fā)展，低溫冷凍技術(shù)得到了大力發(fā)展，不再只是應(yīng)用于食品，更是延伸到了生物學(xué)的各個(gè)研究方向，其中保種育種是一個(gè)方興未艾的方向。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，豬、牛、山羊等哺乳動(dòng)物精子應(yīng)用低溫冷凍技術(shù)在養(yǎng)殖行業(yè)比較多，常見(jiàn)于各類(lèi)新聞報(bào)道，而低溫冷藏則存在著比較突出的弊端，即無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)期保存。隨著魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展以及雜交育種、優(yōu)良品種的選育與提純復(fù)壯等工作的開(kāi)展，魚(yú)類(lèi)精液保存技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。魚(yú)類(lèi)精液的保存方法有常溫保存、冷藏保存和超低溫冷凍保存。常溫保存和冷藏保存用于短期保存精液，而超低溫冷凍則用于長(zhǎng)期保存精液[1]。自20世紀(jì)50年代英國(guó)學(xué)者 Blaxter利用干冰（-79 ℃）成功保存太平洋鯡魚(yú)精巢，在復(fù)蘇后仍能獲得80%以上的受精率后[2]，魚(yú)精子的超低溫保存開(kāi)始引起各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已有200多種魚(yú)類(lèi)精液得到了成功保存的先例。常見(jiàn)的有鯉魚(yú)、四大家魚(yú)、鱈魚(yú)、虹鱒、鮭魚(yú)、大馬哈魚(yú)、歐洲鰻、小體鱘、短吻鱘及花狼魚(yú)等等[3]。大量研究表明，魚(yú)類(lèi)精液的超低溫冷凍保存具有嚴(yán)格的種屬特異性，目前很難找到一種統(tǒng)一通用的方法[4]。

從目前發(fā)展來(lái)看，超低溫冷凍技術(shù)無(wú)論是在醫(yī)學(xué)還是農(nóng)牧漁業(yè)等領(lǐng)域，已表現(xiàn)出了顯著的應(yīng)用價(jià)值[5]，是未來(lái)漁業(yè)發(fā)展中人工授精的一個(gè)樞紐，主要體現(xiàn)以下幾個(gè)方面優(yōu)勢(shì)：（1）大大節(jié)約資源成本。不再需要花費(fèi)大量的物力、人力、財(cái)力來(lái)飼養(yǎng)大量的活體動(dòng)物。（2）使用靈活便捷。不受時(shí)間空間限制，隨時(shí)隨地都能及時(shí)為科研或生產(chǎn)提供精子或胚胎，避免了雄雌性成熟不同步的顧慮，同時(shí)也解決了區(qū)域的遠(yuǎn)近距離問(wèn)題。（3）降低生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。超低溫冷凍技術(shù)能夠最大限度地減少外界環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種質(zhì)資源的干擾，避免了動(dòng)物源性疾病的傳播。（4）能夠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間保存。避免考慮基因丟失、世代間隔、遺傳漂變等活體保種所存在的各種各樣問(wèn)題。（5）通過(guò)冷凍配子能夠擴(kuò)大雜交范圍，同時(shí)避免近交衰退。（6）建立重要物種資源庫(kù)。為建立魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源庫(kù)開(kāi)辟了一條新的途徑[6]。本文則是在超低溫冷凍的基礎(chǔ)上對(duì)此技術(shù)進(jìn)行分析和對(duì)未來(lái)進(jìn)行展望，以期為魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源保護(hù)和魚(yú)類(lèi)遺傳育種的研究提供參考。

1?超低溫冷凍技術(shù)概況

超低溫冷凍技術(shù)是指超低溫（-196 ℃）狀態(tài)下，生物細(xì)胞的代謝活動(dòng)幾乎完全停止，生命活動(dòng)處于靜止?fàn)顟B(tài)，從而使其可以得到長(zhǎng)期保存的一種技術(shù)[7]。超低溫冷凍過(guò)程中，當(dāng)冷凍溫度繼續(xù)下降，冷凍速度達(dá)到一定程度時(shí)，水分子表現(xiàn)為玻璃樣的超微粒結(jié)晶核結(jié)實(shí)均勻的團(tuán)塊[8]。這是液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)（玻璃態(tài)）的固化過(guò)程，是一種可逆的轉(zhuǎn)變，玻璃化冷凍是一種無(wú)晶形固化的物理現(xiàn)象，其本質(zhì)是液體在快速超低溫冷凍過(guò)程中，連續(xù)地固化形成無(wú)晶形、高度黏稠狀態(tài)的玻璃體，玻璃化的主要特點(diǎn)是高濃度冷凍保護(hù)劑和瞬間降溫（-130～-196 ℃，0～-60 ℃是冰晶形成的危險(xiǎn)期），避免冰晶所造成的對(duì)細(xì)胞損傷和凍融效應(yīng)。在超低溫冷凍保存下，可以有效地將細(xì)胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好地保存下來(lái)，經(jīng)最佳條件解凍復(fù)蘇后，細(xì)胞仍然具有原來(lái)的代謝活性和功能性[9]。

2?超低溫冷凍在魚(yú)類(lèi)精液保存中的應(yīng)用

魚(yú)的精子由頭、頸、尾3個(gè)部分組成，頭部含有線粒體，并為精子提供營(yíng)養(yǎng);尾部又稱(chēng)為鞭毛，是精子的運(yùn)動(dòng)器官。精子中主要含有鈉、鉀、鈣、鋅、鎂等金屬元素，其中鈉和鉀占總金屬元素的99.7%～ 99.8%，起著穩(wěn)定滲透壓和抑制精子的作用[10]，整體來(lái)說(shuō)，魚(yú)的精子偏堿性，pH值在7.3～8.5區(qū)間，密度和濃度受季節(jié)的影響[11]。精子在精巢中處于靜止?fàn)顟B(tài)，一旦排入水中，精子便被激活。由于精子的原生質(zhì)極少，能量極其有限，當(dāng)精子排入水中被激活后，壽命很短，因而可以利用降低精子代謝率的方法減少能量的消耗，以達(dá)到延長(zhǎng)精子壽命的目的[12]。在魚(yú)類(lèi)的育種繁殖中，常常出現(xiàn)雌雄性成熟不同步現(xiàn)象，或者是雌雄魚(yú)不同區(qū)域等問(wèn)題，因此解決此問(wèn)題的最佳途徑是通過(guò)對(duì)精子的超低溫冷凍，以達(dá)到隨時(shí)隨地都可進(jìn)行供用的目的。

目前，魚(yú)類(lèi)精子的超低溫冷凍，是在魚(yú)的精子中按照一定比例加入稀釋劑和抗凍劑，以達(dá)到精子內(nèi)外滲透壓的平衡，降低冰點(diǎn)，抑制精子的運(yùn)動(dòng)，使精子處于休眠狀態(tài)而結(jié)構(gòu)又沒(méi)受到損傷，需要時(shí)解凍激活即可。常見(jiàn)的工藝流程為精液采集→鏡檢（活力>80%）→添加稀釋劑和抗凍劑→降溫平衡→液氮保存→解凍復(fù)蘇→活力檢測(cè)→授精。國(guó)外許多學(xué)者早在20世紀(jì) 70年代就對(duì)精子超低溫保存進(jìn)行過(guò)較詳細(xì)的報(bào)道[13-14]。其中，整個(gè)流程，最為關(guān)鍵的是添加稀釋劑、添加抗凍劑、降溫平衡這3個(gè)步驟，可以說(shuō)是直接導(dǎo)致冷凍成敗的主要因素。由于不同種類(lèi)魚(yú)的精子生理特性具有很大差異性，目前沒(méi)有通用的稀釋劑和抗凍劑，每位學(xué)者在做試驗(yàn)中都是根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)以及結(jié)合自己的經(jīng)驗(yàn)對(duì)稀釋劑和抗凍劑進(jìn)行篩選的。冷凍方法常見(jiàn)的有以下4種：小丸顆粒冷凍法、安培瓶冷凍法、塑料離心管法、麥細(xì)管冷凍法。小丸顆粒冷凍法是將混合好的精液直接滴入液氮中保存，解凍時(shí)需要合適的解凍液;其他3種冷凍法的優(yōu)勢(shì)是避免了精液與液氮直接接觸，但安培瓶由于體積較大，降溫難以平衡，且操作復(fù)雜[15]。塑料離心管冷凍法容量大，操作簡(jiǎn)單，存放安全。麥細(xì)管冷凍法相對(duì)來(lái)說(shuō)受溫較快而又均勻，效果好，操作也簡(jiǎn)單。后面的這2種方法是目前主要使用的冷凍方法。無(wú)論是鮮精還是凍精，運(yùn)動(dòng)率都是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。按照精子運(yùn)動(dòng)活力狀態(tài)，大概可以分為4個(gè)等級(jí)。A級(jí)：快速前向運(yùn)動(dòng);B級(jí)：慢速或呆滯前向運(yùn)動(dòng);C級(jí)：非前向運(yùn)動(dòng);D級(jí)：極慢或不動(dòng)[4]。在試驗(yàn)中，通常是選取活力大于80%精子進(jìn)行超低溫保存[16]，活力分析分傳統(tǒng)的顯微鏡觀察和現(xiàn)在主流的依靠計(jì)算機(jī)輔助分析（CASA）等，由于精子被激活后運(yùn)動(dòng)速度快和壽命時(shí)間短暫，傳統(tǒng)的顯微鏡觀察分析視野難以準(zhǔn)確判斷運(yùn)動(dòng)率。相對(duì)而言，計(jì)算機(jī)輔助分析就顯得比較客觀、精準(zhǔn)、快速并且可以量化分析精子的生理特性，因此，根據(jù)目前所報(bào)道的文獻(xiàn)來(lái)看，幾乎是以后者為主[11]。在精子質(zhì)量分析中，主要檢測(cè)AB這2個(gè)級(jí)別精子動(dòng)態(tài)，參數(shù)有以下這些：（1）運(yùn)動(dòng)的直線性（LIN）;（2）平均曲線運(yùn)動(dòng)速度（VCL）;（3）平均直線運(yùn)動(dòng)速度（VSL）;（4）平均路徑運(yùn)動(dòng)速度（VAP）;（5）精子平均側(cè)擺幅值（ALH）;（6）精子平均鞭打頻率（BCF）;（7）精子平均移動(dòng)角度（MAD）;（8）運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性（WOB）;（9）運(yùn)動(dòng)的前向性（SRT）;（10）檢測(cè)所用時(shí)間（T）等等。

3?影響?hù)~(yú)精液超低溫冷凍的因素

由于超低溫冷凍步驟比較多，每個(gè)步驟在冷凍解凍操作過(guò)程中不同階段損傷的累積會(huì)影響后續(xù)試驗(yàn)精子的死活。精液質(zhì)量、稀釋液的選擇和比例的確定、pH值、滲透壓、抗凍劑的選擇和毒性、平衡條件、凍融方法以及授精條件等等都是水生動(dòng)物精液低溫保存能否成功的因素。其中影響最大的分別是低溫保存劑和凍融方法，直接關(guān)系到試驗(yàn)中精子冷凍后復(fù)溫能否存活。

3.1?稀釋液的影響

魚(yú)的精子排出體外后，由于環(huán)境變化、營(yíng)養(yǎng)消耗，、能量代謝等原因，導(dǎo)致精子的存活時(shí)間縮短，從而死亡。因此，需要配制一種溶液來(lái)維持精子在體外的生理狀態(tài)，稀釋液一般沒(méi)有毒性，對(duì)精子也沒(méi)有激活效果。稀釋液是第一個(gè)與精子直接接觸的外來(lái)成分，是精子保存液的滲透壓、pH值、代謝調(diào)節(jié)、能量來(lái)源的主要“閥門(mén)”[17]。稀釋液的作用是使精子不受損害地以靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入凍結(jié)狀態(tài)，以延長(zhǎng)精子的壽命。另外，稀釋液還能稀釋加進(jìn)來(lái)的抗冷劑的濃度，降低抗凍劑對(duì)精子的毒害強(qiáng)度[18]。由于不同魚(yú)類(lèi)精子的特殊性，所以配制的稀釋液也不同，到目前為止，仍然沒(méi)有通用的稀釋液[19]。常見(jiàn)的稀釋液有鹽類(lèi)（如碳酸氫鈉、氯化鈉、碳酸氫鉀、檸檬酸鈉等）、糖類(lèi)（如葡萄糖、蔗糖、果糖等）、脂類(lèi)（主要是磷脂）和蛋白質(zhì)（如卵黃、牛奶、小牛血清等）以及其他添加劑（如維生素、抗生素等）[11]。海水魚(yú)用葡萄糖和檸檬酸鈉組成的稀釋液效果較好;淡水魚(yú)類(lèi)稀釋液則以氯化鈉和氯化鉀為主，加入少量氯化鈣、氯化鎂、碳酸氫鈉和葡萄糖[20]。同時(shí)，不同濃度的稀釋液對(duì)精子有著很大的影響作用。顧正選等發(fā)現(xiàn)，使用0.5%濃度的NaCl溶液，齊口裂腹魚(yú)的精子運(yùn)動(dòng)活力最好[21];魏開(kāi)金等發(fā)現(xiàn)，使用0.5%濃度NaCl稀釋液，鰣魚(yú)的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命達(dá)到最長(zhǎng)[22];李飛等認(rèn)為，0.6%濃度的NaCl對(duì)胭脂魚(yú)精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命都具有較佳的效果[23]。在稀釋液中，pH值的差異也最為關(guān)鍵，不同pH值對(duì)不同魚(yú)精子的壽命活力起到了不一的結(jié)果。大體上來(lái)說(shuō)，魚(yú)的精子是中性或者偏堿性，酸性環(huán)境容易破壞精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使精子失活。楊彩根等發(fā)現(xiàn)，黃顙魚(yú)的精子在pH值7～9時(shí)活力最好[24]。孫翰昌等發(fā)現(xiàn)，禾花魚(yú)精子在pH值為7時(shí)活力最強(qiáng)[25]。朱冬發(fā)等認(rèn)為，適宜大黃魚(yú)精子的pH值是7.5～8.0[26]。Na+、Ca2+、Mg2+ 、K+ 等離子既是魚(yú)類(lèi)精子的重要組成部分，同時(shí)也是構(gòu)成滲透壓的主要物質(zhì)，對(duì)滲透壓維持起到了重要作用[27]。不同離子在不同魚(yú)類(lèi)中所起的作用各有不同，K+在鮭科魚(yú)類(lèi)中起著抑制精子活力的作用，但在鯉科魚(yú)類(lèi)中卻能提高精子運(yùn)動(dòng)速度、延長(zhǎng)精子活力時(shí)間[28]。所以在配制稀釋液時(shí)要根據(jù)對(duì)應(yīng)的魚(yú)類(lèi)選擇相對(duì)應(yīng)的試劑，有利于提高精子冷凍的效果。在選擇和配制稀釋液時(shí)，盡量滿(mǎn)足以下條件：（1）溶液的等滲性和各成分互不反應(yīng);（2）能為精子提供適宜的環(huán)境和適宜的pH值;（3）不能含有對(duì)精子有害的物質(zhì)和含有抗菌物質(zhì)[17];（4）在保證精子生存環(huán)境的前提下，其成分組成越簡(jiǎn)單越好[13]。

3.2?抗凍劑的影響

抗凍劑的選擇決定了精子在凍存中的生死存亡，抗凍劑通常是低分子中性物質(zhì)，原理是通過(guò)結(jié)合水分子，發(fā)生了水合作用，黏性增加，降低形成冰晶的結(jié)冰點(diǎn)，從而阻止冰晶對(duì)于精子造成不可逆變的機(jī)械損傷，從而達(dá)到抗凍的目的。常見(jiàn)得抗凍劑有二甲基亞砜（DMSO）、甘油（Gly）、甲醇（MeOH）、丙二醇（PG）、乙二醇（EG）、單糖、二糖等等，其中，這又分為可滲透和不可滲透2種。DMSO、酰胺類(lèi)、乙醇類(lèi)屬于可滲透;單糖、二糖、多糖、聚合物等屬于不可滲透。不同動(dòng)物的種質(zhì)細(xì)胞對(duì)加入抗凍劑的適應(yīng)性和敏感性也不同[29]。王小剛等將10%～25%甲醇（MeOH）用于點(diǎn)帶石斑魚(yú)精子冷凍保存沒(méi)有獲得復(fù)活率[18]。而夏良萍等用10%甲醇（MeOH）對(duì)黃顙魚(yú)精子冷凍保存有較好的保護(hù)效果[30];Chew等把乙二醇（EG）用于穗須原鯉精子超低溫凍存試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)效果不如甲醇（MeOH）好[31]。而程順等發(fā)現(xiàn)，乙二醇（EG）在翹嘴鲌精子超低溫凍存中取得最好的效果[32]。一般來(lái)說(shuō)，抗凍劑對(duì)精子都存在著一定的毒性，當(dāng)抗凍劑的濃度越大，毒性就越強(qiáng)，精子活力就越低[33]。這一觀點(diǎn)已得到眾多學(xué)者的認(rèn)可。何斌等研究發(fā)現(xiàn)，甲醇（MeOH）、乙二醇（EG）、DMSO等抗凍劑隨著濃度的增加會(huì)導(dǎo)致魚(yú)精子的活力和運(yùn)動(dòng)時(shí)間相對(duì)應(yīng)地下降[34]。閆秀明等研究發(fā)現(xiàn)，10%的DMSO對(duì)黃鱔精子的抗凍保護(hù)作用最好，毒性作用最弱[35]。王明華等認(rèn)為，10%甲醇（MeOH）濃度對(duì)美洲鰣魚(yú)精子保存效果最好，超過(guò)15%濃度會(huì)導(dǎo)致精子死亡[36]。同時(shí)平衡時(shí)間的長(zhǎng)短和溫度的高低與抗凍劑毒性也存在著一定的關(guān)聯(lián)。在配制抗凍劑的過(guò)程中，幾種抗凍劑的聯(lián)合使用，有利于降低毒性，提高精子的活力[37]。同時(shí)滲透性和非滲透性抗凍劑混用有利于保持細(xì)胞膜的完整性，選擇抗凍劑時(shí)優(yōu)選選擇低毒性抗凍劑，同時(shí)使用過(guò)程中盡量縮短抗凍劑和精子的接觸時(shí)間，添加過(guò)程中可以考慮分步添加[38]，以免毒性過(guò)大直接導(dǎo)致精子死亡。抗凍劑對(duì)細(xì)胞的毒性主要發(fā)生在凍前和凍后處理的2個(gè)階段，抗凍劑加入時(shí)一步添加和分步添加都是根據(jù)不同魚(yú)種不同抗凍劑來(lái)選擇的;復(fù)蘇后將抗凍劑稀釋或者洗脫，稀釋和洗脫也有要求，如果添加或去除時(shí)操作不當(dāng)，容易引起細(xì)胞損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。總的來(lái)說(shuō)，選擇或者配制抗凍劑時(shí)，要根據(jù)以下幾個(gè)原則來(lái)執(zhí)行：（1）抗凍劑對(duì)精子無(wú)毒或者盡量低毒;（2）抗凍劑對(duì)于精子不能有激活效果;（3）抗凍劑應(yīng)具有營(yíng)養(yǎng)性，增加精子的抗冷性能;（4）抗冷劑成分簡(jiǎn)單易配。

3.3?其他因素的影響

除了稀釋劑和抗凍劑兩大主要因素對(duì)精子的成活率造成影響外，凍融方法的影響緊跟其后，0～60 ℃是造成細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)的機(jī)械損傷危險(xiǎn)區(qū)[17]，適度降溫，細(xì)胞越過(guò)了危險(xiǎn)區(qū)則可以投入液氮中直接長(zhǎng)期保存。Stoss等在-20～-30 ℃溫度中保存銀大麻哈魚(yú)的受精卵復(fù)蘇后沒(méi)成活率，在-60～-100 ℃ 中保存泥鰍、草魚(yú)的胚胎，獲得10%～25%的胚胎復(fù)活率[14]。在冷凍過(guò)程中，降溫和復(fù)蘇都會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)水產(chǎn)生冰晶形成從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。因此，冷凍的步驟相對(duì)來(lái)說(shuō)在整個(gè)超低溫冷凍鏈中有著非同小可的位置。一般而言，降溫分為3種形式：（1）慢速降溫;（2）2步降溫;（3）3步降溫[39]。眾多文獻(xiàn)資料顯示，2步降溫法和3步降溫法在試驗(yàn)中比較常用。當(dāng)降溫后精子能夠在液氮中長(zhǎng)期保存后，復(fù)溫的過(guò)程就顯得極其重要，就算細(xì)胞以最佳的降溫方式保存于液氮中，也有可能在復(fù)溫過(guò)程中造成機(jī)械損傷而死亡。一般而言，降溫速度快的話(huà)，復(fù)溫的速度也需要相對(duì)應(yīng)地加快，而在絕對(duì)值上，復(fù)溫速度還是要比冷卻速度快很多[40]，常用的復(fù)溫方式是水浴，35～40 ℃的溫水在1～2 min 內(nèi)完成[41]。但也有學(xué)者通過(guò)室溫就能解凍成功。林丹軍等在室溫（21～25 ℃）解凍大黃魚(yú)精子取得不錯(cuò)的效果[42]。當(dāng)復(fù)溫成功后，抗凍劑的去除是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題，由于動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，所以無(wú)法像植物一樣使用離心方法去除抗凍劑，相關(guān)學(xué)者都是通過(guò)添加溶液稀釋抗凍劑的毒性，若稀釋過(guò)程中溶液有著pH值、滲透壓的影響，會(huì)導(dǎo)致解凍后細(xì)胞的死亡?？箖鰟┤コ?，激活液的選擇也至關(guān)重要。由于魚(yú)精子添加了抗凍劑和稀釋劑，鮮精直接用水激活的方法已不適用解凍后的精子激活。陳松林等研究表明，由于DMSO的作用，冷凍過(guò)程中精子的滲透壓會(huì)升高，若直接水激活，則導(dǎo)致內(nèi)外滲透壓過(guò)大，精子吸水后膨脹，活力大大下降[43]，所以一般選擇配制溶液為激活液。

4?結(jié)論

目前來(lái)說(shuō)，魚(yú)精子的超低溫保存已取得了很大的進(jìn)步，可以應(yīng)用于漁業(yè)生產(chǎn)，解決生產(chǎn)上一定范圍內(nèi)的難題。但是在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，幾乎很少有學(xué)者報(bào)道精卵受精量比，如果用超過(guò)鮮精數(shù)量的凍精，10倍或數(shù)10倍的數(shù)量與一定數(shù)量的卵子配對(duì)，就算凍精活力很低，也能獲得比較高的受精率。通過(guò)提高數(shù)量來(lái)掩蓋凍存精子上存在的缺陷，相對(duì)來(lái)說(shuō)是超低溫冷凍上存在的不足，阻礙了技術(shù)的發(fā)展。另外許多魚(yú)類(lèi)的精子超低溫凍存只是存在于試驗(yàn)摸索階段，影響試驗(yàn)成果的因素很多，導(dǎo)致試驗(yàn)重復(fù)性差。大量的研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)凍存后的精子多少都受到了深淺不一的低溫?fù)p傷（冰晶損傷、溶質(zhì)損傷等），活力和受精率相對(duì)鮮精來(lái)說(shuō)，還是略遜一籌。這是由于精子在溫度下降的過(guò)程中耐不了低溫而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)以及功能性破壞，另一方面是加入的抗凍劑的毒性影響了精子內(nèi)外滲透壓的平衡從而導(dǎo)致了精子的凍傷，每種抗凍劑的毒理藥理導(dǎo)致精子死亡的機(jī)制至今沒(méi)有多少學(xué)者進(jìn)行深入探索和發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，對(duì)于精子在超低溫冷凍過(guò)程中造成的損傷本質(zhì)所了解得還是不夠深入透徹，還有待進(jìn)一步研究探索。關(guān)于冷凍前是否需要平衡，不同學(xué)者觀點(diǎn)不一樣，有的學(xué)者認(rèn)為，DMSO等抗凍劑滲透性比較強(qiáng)，能容易地滲透到精子內(nèi)部，凍前不平衡比平衡效果好[44]，但丁淑燕等在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，平衡比不平衡效果好[45]。對(duì)于超低溫冷凍后復(fù)溫是否需要洗脫抗凍劑，目前也是沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)蘇時(shí)水浴的溫度和時(shí)間分別是多少最為合適，也是沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)界限。魚(yú)精子凍存解凍過(guò)程中受損必然導(dǎo)致受精能力衰退，如何發(fā)揮超低溫凍存的優(yōu)勢(shì)，又縮小凍精和鮮精之間的差距，是學(xué)者們的共同研究方向[46]。就目前情況而言，精子的超低溫冷凍在未來(lái)的發(fā)展中還是任重道遠(yuǎn)，有待進(jìn)一步深入研究和探索。

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