正常白蛋白尿期糖尿病患者血清miR-16-5p與FGF2的相關(guān)性及在腎損傷隨訪中的意義

唐平易， 張 琳， 唐東興， 劉立亞

微小RNA(microRNA,miR)是一類調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼小分子RNA。新的證據(jù)表明，miR在糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)的發(fā)病中起著非常重要的作用[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA-16-5p(miR-16-5p)與DKD相關(guān)[2-3]，可能調(diào)控有關(guān)基因參與炎癥、腎血管重構(gòu)和間質(zhì)纖維化過程，但如何導(dǎo)致和促進(jìn)糖尿病患者腎損傷的機(jī)制目前尚不完全清楚。成纖維細(xì)胞生長因子2(fibrolast growth factor 2,FGF2)作為慢性腎臟病重要的致病因子已得到廣泛認(rèn)可，其在糖尿病腎病患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，可導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，是DKD重要的損傷因子[4]。miR-16-5p是否通過調(diào)控FGF2表達(dá)參與DKD的早期腎損害目前未見報道。本研究擬通過對正常白蛋白尿期的2型糖尿病患者進(jìn)行隨訪觀察，測定其血清miR-16-5p和FGF2水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析和生物信息學(xué)分析，同時測定腎血管阻力指數(shù)等腎損傷指標(biāo)，探討miR-16-5p在DKD早期腎損傷中的可能作用機(jī)制。

1 對象與方法

1.1對象 本研究以課題組前期研究收集的2016年6-10月衡鋼社區(qū)體檢和南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院就診的78例2型糖尿病患者為觀察對象。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為2型糖尿病，病程>10年;入組即時尿標(biāo)本白蛋白/肌酐比率(urinary albumin creatinine ratio,UACR)<30 mg/g(3次非同日尿標(biāo)本檢測中，2次及以上均<30 mg/g);糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)水平控制在4%～7%;自愿參加此項(xiàng)調(diào)查研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：過去3月內(nèi)及觀測期間有發(fā)熱及急慢性炎癥，有其他急慢性腎病、高血壓病，急慢性傳染性疾病，嚴(yán)重血液、心、肝、肺、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，器官移植、腫瘤、自身免疫性疾病及合并其他遺傳和(或)代謝異常性疾病者。觀測期間有劇烈運(yùn)動、高蛋白飲食及使用對蛋白尿有影響的藥物(如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等)及不配合隨訪者。最終至截止觀察期24月后，剩余病例60例，男性31例，女性29例，年齡(58.9±9.8)歲(39～72歲)。依據(jù)前期研究確定的DKD患者血清miR-16-5p診斷界值為0.665[3]，將病例組分為血清miR-16-5p水平<0.665(A)組和≥0.665(B)組。選取衡鋼社區(qū)同期體檢的78例健康隨機(jī)個體為對照組(C組)。24月觀測期間未有發(fā)熱、劇烈運(yùn)動、高蛋白飲食等任何可能影響蛋白尿生成的行為并堅(jiān)持配合隨訪。最終至截止觀察期C組剩余70例，男性37例，女性33例，年齡(56.1±9.9)歲(32～72歲)。本研究均已獲得受測者知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本留取和檢測 所有受試者于清晨空腹留取血標(biāo)本和尿標(biāo)本，用于檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、HbA1c、血清miR-16-5p、FGF2、尿白蛋白和尿肌酐(留取3次非同日尿標(biāo)本)，計(jì)算UACR(取3次UACR平均值)。隨訪24月后，留取3次非同日尿標(biāo)本檢測尿白蛋白和尿肌酐，其中兩次及以上均>30 mg/g判定為微量白蛋白尿或明顯蛋白尿。用于檢測miR-16-5p和FGF2的血清標(biāo)本于-80 ℃冰箱保存，于標(biāo)本收集結(jié)束后統(tǒng)一檢測，其余檢測均于標(biāo)本留取當(dāng)天完成。標(biāo)本留取、保存及FBG、HbA1c、miR-16-5p、尿白蛋白和尿肌酐檢測具體方法均參照課題組前期研究[5]，血清FGF2采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，試劑盒購自美國R&D Systems公司，酶標(biāo)儀為Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo公司)，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2腎臟超聲檢查 所有研究對象在入組時和隨訪24月后，于清晨空腹由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲診斷醫(yī)師完成腎臟B超檢測。檢查設(shè)備為LOGIQ 3 Expert型GE彩色超聲診斷儀。具體操作如下：被檢查者取側(cè)臥位，首先選擇3.5 MHz探頭，腎臟模式掃描，初步觀察腎臟形態(tài)、內(nèi)部回聲，并測量和記錄與長軸垂直的腎臟最大橫切面積。然后改用彩色多普勒模式觀察腎臟血流情況，并記錄腎主動脈(master renal artery,MRA)、腎錐體間葉間動脈(interlobar renal artery,IRA)與腎竇部段動脈(segmental renal artery,SRA)的阻力指數(shù)(resistance index,RI)。每位被測者左、右腎臟檢測重復(fù)3次，取平均值為其最終測量數(shù)值。

1.2.3生物學(xué)數(shù)據(jù)庫分析靶向結(jié)合關(guān)系 為明確miR-16-5p與FGF2基因表達(dá)之間的可能相關(guān)性，通過查詢miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)兩種miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫，分別分析miR-16-5p與FGF2基因的可能靶向結(jié)合關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1一般資料及分組情況 對入組時研究對象的一般資料特征進(jìn)行分析。病例組A和B組分別與對照組(C組)在性別、年齡、血壓兩兩比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A，B組血清miR-16-5p水平明顯低于C組(P<0.01,P<0.05);而FPG,HbA1c,UACR及最大橫切面面積、各級血管阻力指數(shù)和FGF2均高于C組(P<0.05或P<0.01)。A，B組間FPG，HbA1c，UACR及最大橫切面面積和血管(IRA和SRA)阻力指數(shù)比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但A組miR-16-5p水平明顯低于B組(P<0.01)，MRA阻力指數(shù)和FGF2水平明顯高于C組(P<0.05，P<0.01，表1)。

表1 研究對象一般資料特征

1 mmHg=133.3 Pa. FPG：空腹血糖； HbA1c：糖化血紅蛋白； UACR：尿標(biāo)本白蛋白/肌酐比率； RIMRA：腎主動脈阻力指數(shù)；RIIRA：腎錐體間葉間動脈阻力指數(shù)； RISRA：腎竇部段動脈阻力指數(shù)； FGF2：成纖維細(xì)胞生長因子2. A組：血清miR-16-5p水平<0.665； B組：血清miR-16-5p水平≥0.665； C組：對照組. 與C組比較，☆：P<0.01，#：P<0.05； A與B組比較，$：P<0.05，￥：P<0.01.

2.2入組時miR-16-5p與FGF2相關(guān)性 對病例(A+B)組入組時血清miR-16-5p表達(dá)水平與FGF2水平進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)二者之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.683，P<0.01)。A，B組FGF2表達(dá)水平進(jìn)行比較，A組FGF2水平明顯高于B組(P<0.01，表1)。

2.3生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 通過miRDB數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)FGF2基因3′-UTR區(qū)存在4個“5′-UGCUGCU-3′”核苷酸片段序列，為miR-16-5p種子序列“5′-AGCAGCA-3′”靶向結(jié)合位點(diǎn)，而TargetScan數(shù)據(jù)庫查詢同樣也發(fā)現(xiàn)FGF2基因3′-UTR區(qū)存在5個核苷酸片段序列是miR-16-5p種子序列的潛在靶向識別位點(diǎn)，包含了前者4個序列。相同的序列分別位于FGF2基因3′-UTR區(qū)1 113～1 119、5 066～5 073、5 599～5 606、5 640～5 647位核苷酸序列區(qū)。

2.4隨訪后尿白蛋白發(fā)生情況比較 隨訪24月后，病例(A+B)組出現(xiàn)微量白蛋白尿或明顯蛋白尿的總發(fā)生率為35.00%，其中A組18例(43.90%)，而B組3例(15.79%)，兩組白蛋白尿轉(zhuǎn)化發(fā)生率比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而C組轉(zhuǎn)化發(fā)生率為0。

2.5不同組腎臟超聲指標(biāo)變化情況 所有研究對象在入組時行腎臟超聲探查，腎臟實(shí)質(zhì)回聲無明顯異常，隨訪24月后實(shí)質(zhì)回聲均無明顯異常改變。為進(jìn)一步了解各研究對象腎臟超聲觀察指標(biāo)變化情況，取各觀察指標(biāo)變化(△=隨訪結(jié)束時測量值-入組時測量值)。A，B組腎臟最大橫切面積增加均大于C組(P均<0.01)，且A組橫切面積增大超過B組(P<0.05)。同樣A，B兩組各血管阻力指數(shù)增加值均大于C組(P均<0.01)，且A組血管阻力指數(shù)增加值超過B組(P均<0.05，表2)。

表2隨訪24月后腎臟超聲指標(biāo)變化情況比較

Tab 2The changes of renal ultrasound indexes were compared after 24 months of follow-up

腎臟超聲指標(biāo)A組B組C組n411970s最大橫切/cm25.21±4.60☆#3.25±3.98☆0.22±1.67△RIMRA0.045±0.047☆#0.019±0.0340.011±0.021△RIIRA0.042±0.046☆#0.019±0.0300.010±0.019△RISRA0.043±0.045☆#0.020±0.0300.010±0.019

3 討 論

DKD是我國終末期腎病的常見原因之一，是糖尿病的慢性并發(fā)癥，經(jīng)歷了從無明顯白蛋白尿向微量白蛋白尿、大量白蛋白尿、終末期腎功能衰竭漸進(jìn)發(fā)展的臨床過程。臨床上發(fā)現(xiàn)，在發(fā)展為臨床蛋白尿之前，同樣存在一個較長的腎損傷階段。盡管通過控制血糖和血壓等治療，仍不足以完全阻斷DKD患者腎損傷病情進(jìn)展[6]，其機(jī)制尚不完全清楚。明確腎損傷的可能機(jī)制并開展有效的干預(yù)將有利于改善糖尿病患者預(yù)后。

研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)下調(diào)的miR-16-5p與DKD患者病情密切相關(guān)。低表達(dá)的miR-16-5p可通過上調(diào)不同的靶基因表達(dá)參與炎癥、微血管功能障礙和纖維化等過程。通過提高miR-16-5p的表達(dá)能減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化損傷[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，處于正常白蛋白尿期的2型糖尿病患者血清miR-16-5p表達(dá)明顯低于對照組；而臨床常用于監(jiān)測糖尿病病情的指標(biāo)，如FBG、HbA1c、尿白蛋白、腎臟體積和腎血管阻力指數(shù)指標(biāo)卻高于對照組，這提示miR-16-5p的低表達(dá)可能與早期DKD病情相關(guān)。

腎小球硬化、微血管病變和腎間質(zhì)纖維化等病理改變是早期DKD腎損傷的有效觀察指標(biāo)。但腎臟病理檢查是有創(chuàng)檢測，并不適合作為預(yù)防疾病的觀測指標(biāo)。本研究選取了UACR和超聲腎臟最大橫切面積、腎血管阻力指數(shù)作為早期腎損傷觀察指標(biāo)。DKD初期患者的臨床腎臟超聲檢查并無明顯腎實(shí)質(zhì)回聲變化，但隨著正常白蛋白尿期向微量白蛋白尿和大量白蛋白尿進(jìn)展，腎血管阻力指數(shù)逐漸增加，腎臟體積可暫時增加。超聲腎臟最大橫切面積、腎血管阻力指數(shù)可作為早期DKD患者檢測腎臟損傷的指標(biāo)。隨訪24月后，A組有43.90%的患者進(jìn)展為微量白蛋白尿或明顯蛋白尿，發(fā)生率明顯高于B組(15.79%,P<0.05)，C組卻沒有出現(xiàn)白蛋白尿轉(zhuǎn)化發(fā)生情況。超聲檢查顯示A組腎臟最大橫切面積和血管阻力指數(shù)24月后較基線值增加明顯高于B，C組(P均<0.05)。由此可見，miR-16-5p下調(diào)幅度大者更容易出現(xiàn)腎損傷，miR-16-5p水平的下降可能加劇正常白蛋白尿2型糖尿病患者的腎損傷。

本研究通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)，正常白蛋白尿期的患者血清FGF2表達(dá)水平明顯高于對照組。同時分析發(fā)現(xiàn),該期患者miR-16-5p表達(dá)水平與FGF2表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，且A組患者FGF2水平明顯高于B組。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)軟件分析證實(shí),miR-16-5p與FGF2編碼基因3’-UTR區(qū)存在靶向結(jié)合關(guān)系。FGF2是DKD發(fā)生發(fā)展的重要影響因子。FGF2高表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞受損有關(guān)；FGF2高表達(dá)可以引起足細(xì)胞足突融合、消失、退縮，甚至從腎小球基底膜分離，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障受損，對蛋白通透性增加，發(fā)生蛋白尿；FGF2高表達(dá)還可以作用于腎小管上皮細(xì)胞使其表達(dá)成纖維細(xì)胞特征蛋白，發(fā)生上皮-間葉轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitios,EMT)，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[8-9]，引起血管變形；同時可以作用于系膜細(xì)胞引起系膜損傷和增生[10]，使毛細(xì)血管管腔變小，進(jìn)而發(fā)展為結(jié)節(jié)性腎小球硬化，從而增加血管阻力。結(jié)節(jié)性腎小球硬化是DKD的特征性病理改變，微血管病變和間質(zhì)纖維化是其本質(zhì)表現(xiàn)。纖維化也可發(fā)生在早期DKD[11]。因此，筆者認(rèn)為，miR-16-5p顯著低表達(dá)可通過上調(diào)FGF2加重早期DKD患者腎損傷，導(dǎo)致其隨訪后出現(xiàn)尿白蛋白增加和血管阻力指數(shù)增加，miR-16-5p/FGF2可能是DKD早期腎損傷重要的調(diào)控通路。

總之，本研究選擇正常白蛋白尿期的糖尿病患者與健康對照進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)的miR-16-5p與上調(diào)的FGF2密切相關(guān)，隨訪腎損傷發(fā)生率更高，miR-16-5p可能通過上調(diào)FGF2表達(dá)影響早期2型糖尿病患者腎損傷病情進(jìn)展。本研究由于所選的糖尿病患者受具體病程、治療方法等因素影響，且為觀察性研究，存在一些局限性，下一步仍需通過擴(kuò)大樣本量、增加觀察時間和更深入的臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。