lncRNA ANRIL在銀屑病患者病變皮膚組織中的表達(dá)及其臨床意義

金 曌， 陳 慧， 程 楊， 蘇 慧， 付 霆

銀屑病是一種常見(jiàn)的與免疫相關(guān)的慢性炎癥皮膚病，歐美人群的發(fā)病率約為2%[1-2]。銀屑病的病程長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率高，不僅影響美觀，還會(huì)引發(fā)多種并發(fā)癥，如銀屑病關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、心血管疾病以及導(dǎo)致患者發(fā)病率和死亡率增加的抑郁癥等，極大危害患者的身心健康，降低患者的生活質(zhì)量[3-4]。然而，銀屑病迄今尚無(wú)可治愈的藥物或治療方法。因此，尋找與銀屑病發(fā)生、疾病嚴(yán)重程度以及炎癥水平相關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)銀屑病患者病情的監(jiān)測(cè)以及改善患者預(yù)后具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，參與調(diào)控多種生物學(xué)功能，如胚胎干細(xì)胞的分化、腫瘤的發(fā)生等生理或病理過(guò)程[5-8]。INK4位點(diǎn)的反義非編碼RNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus, ANRIL)是一條從染色體9p21.3轉(zhuǎn)錄而來(lái)的lncRNA，長(zhǎng)為3.8 kb。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANRIL的水平與牙周炎、冠狀動(dòng)脈疾病(coronary artery disease, CAD)和缺血性卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)[9-14]，說(shuō)明lncRNA ANRIL與炎癥關(guān)系緊密，而銀屑病也是一種以高度炎癥為特征的皮膚疾病。因此，推測(cè)lncRNA ANRIL在銀屑病的發(fā)病和進(jìn)展中也有著重要作用。本研究旨在評(píng)估lncRNA ANRIL在銀屑病患者病變皮膚組織中的表達(dá)水平及其與疾病嚴(yán)重程度和炎癥因子水平的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 連續(xù)納入于2016年7月-2018年6月就診的銀屑病患者204例，男性122例，女性82例，年齡(46.4±12.4)歲(19～87歲)，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)為(23.6±4.10)kg/m2(14.4～33.9 kg/m2)，中位病程、受累體表面積(body surface area, BSA)和銀屑病皮損面積及嚴(yán)重度指數(shù)(psoriasis area and severity index, PASI)分別為10.0年(5.0～14.8年)，19.0%(16.0%～22.0%)和8.4(6.8～12.1)。正在接受局部治療、光療、系統(tǒng)性非生物或生物制劑治療的患者分別有186，172，140和22例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為銀屑?。?2)年齡>18歲；(3)同意鉆取皮膚病變組織及附近非病變組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除伴隨除銀屑病以外的皮膚炎癥疾病，或伴隨其他系統(tǒng)性免疫疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等患者。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1收集數(shù)據(jù)及獲取樣本 記錄患者的年齡、性別、BMI、病程、銀屑病受累BSA，并評(píng)估PASI評(píng)分。記錄患者正在使用的藥物類型，排除藥物對(duì)lncRNA ANRIL水平的影響。鉆取3 mm深度的病變皮膚組織標(biāo)本及病變5 cm外的配對(duì)正常皮膚組織標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測(cè) 采用qPCR檢測(cè)病變皮膚組織及配對(duì)正常皮膚組織的lncRNA ANRIL表達(dá)量，并檢測(cè)病變皮膚組織標(biāo)本的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-17和IL-22 mRNA表達(dá)量。具體操作如下：采用Trizol (美國(guó)Invitrogen公司)提取組織總RNA后，采用PrimeScript RT reagent (日本TaKaRa公司)進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，然后采用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (日本TaKaRa公司)進(jìn)行qPCR定量檢測(cè)。以磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。lncRNA和GAPDH引物均根據(jù)NONCODE數(shù)據(jù)庫(kù)和National Center for Biotechnology Information (NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)。

表1 qPCR引物序列

lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；ANRIL：INK4位點(diǎn)的反義非編碼RNA；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素; GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶.

2 結(jié) 果

2.1lncRNA ANRIL表達(dá)水平在區(qū)分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織中的作用 qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA ANRIL在病變皮膚組織[2.135(1.013～3.343)]中的表達(dá)量高于配對(duì)正常皮膚組織[1.131(0.506～1.833)](P<0.001, 圖1A)。lncRNA ANRIL表達(dá)水平區(qū)分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織的ROC曲線下面積(area under the curve, AUC)為0.711(95%CI：0.656～0.766)，取最佳切割點(diǎn)lncRNA ANRIL表達(dá)量1.966為閾值時(shí)(定義為ROC曲線上特異度+敏感度為最大值的點(diǎn))，其區(qū)分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織的敏感度為54.9%，特異度為78.6%(圖1B)。

圖1 lncRNA ANRIL在銀屑病病變組織和正常皮膚組織中的表達(dá)差異Fig 1 The differential expressions of lncRNA ANRIL in psoriatic lesions and normal skin tissues

2.2lncRNA ANRIL表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)聯(lián) 病變皮膚組織lncRNA ANRIL表達(dá)量與PASI評(píng)分正相關(guān)(r=0.261，P<0.001)，而與患者的年齡(r=0.080,P=0.257)、BMI(r=0.063,P=0.370)、病程(r=0.017,P=0.814)或受累BSA(r=0.118，P=0.092)無(wú)相關(guān)性(表2)。此外，病變皮膚組織的lncRNA ANRIL表達(dá)量與性別(P=0.118)、局部治療(P=0.913)、光療(P=0.252)、系統(tǒng)性非生物制劑治療(P=0.644)或系統(tǒng)性生物制劑治療(P=0.625)同樣無(wú)關(guān)(表3)。

表2病變皮膚組織lncRNA ANRIL相對(duì)表達(dá)量與患者臨床特征(連續(xù)變量)的關(guān)聯(lián)分析

Tab 2Association between lncRNA ANRIL relative expression in psoriatic lesions and clinical characteristics (continuous variable) of psoriatic patients

臨床特征(連續(xù)變量)相關(guān)系數(shù)rP值年齡0.0800.257BMI0.0630.370病程0.0170.814受累BSA0.1180.092PASI評(píng)分0.261<0.001

lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；ANRIL：INK4位點(diǎn)的反義非編碼RNA；BMI：體質(zhì)量指數(shù)；BSA：體表面積；PASI：銀屑病皮損面積及嚴(yán)重度指數(shù).

表3病變皮膚組織lncRNA ANRIL相對(duì)表達(dá)量和患者臨床特征(分類變量)的關(guān)聯(lián)

Tab 3Association of lncRNA ANRIL relative expression in psoriatic lesions with clinical characteristics (classified variable) of psoriatic patients

臨床特征(分類變量)lncRNA ANRIL相對(duì)表達(dá)量性別 女2.304(1.112～3.705) 男1.958(0.954～3.202)局部治療 無(wú)2.019(0.940～3.295) 有2.165(1.022～3.366)光療 無(wú)2.500(1.213～3.983) 有2.117(0.985～3.269)系統(tǒng)性非生物制劑治療 無(wú)2.243(1.205～3.424) 有2.071(0.903～3.295)系統(tǒng)性生物制劑治療 無(wú)2.071(0.982～3.401) 有2.376(1.170～3.223)

lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；ANRIL：INK4位點(diǎn)的反義非編碼RNA.

2.3影響PASI評(píng)分的因素分析 單元線性回歸分析提示，病變皮膚組織lncRNA ANRI表達(dá)水平(P=0.001)、年齡(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治療(P=0.005)均與更高的PASI評(píng)分相關(guān)；多元線性回歸(逐步)分析顯示，病變皮膚組織lncRNA ANRIL高表達(dá)(P=0.013)、較大的受累BSA(P<0.001)和局部治療(P=0.008)與患者PASI評(píng)分更高獨(dú)立相關(guān)(表4)。

2.4病變皮膚組織lncRNA ANRIL表達(dá)量與炎癥因子水平的關(guān)聯(lián) qPCR檢測(cè)顯示，病變皮膚組織中TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22 mRNA的表達(dá)量分別為2.223(1.417～2.985)，1.736(1.086～2.521)，2.529(1.504～3.750)，2.397(1.610～3.417)和2.782(1.642～4.220)。Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)顯示，病變皮膚組織中，lncRNA ANRIL表達(dá)量與TNF-α(r=0.248,P<0.001)、IL-6(r=0.219,P=0.002)和IL-17(r=0.252,P<0.001)表達(dá)水平正相關(guān)，而與IL-8(r=0.065,P=0.355)和IL-22(r=0.097,P=0.069)表達(dá)水平無(wú)顯著相關(guān)性(表5)。

3 討 論

lncRNA ANRIL不僅是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及介導(dǎo)細(xì)胞耐藥的重要基因，還是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要參與者[15-16]。研究報(bào)道，lncRNA ANRIL可通過(guò)激活半胱天冬酶結(jié)構(gòu)域家族成員8(caspase recruitment domain family member 8, CARD8)來(lái)抑制核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)途徑，從而抑制缺血性腦卒中患者的炎癥反應(yīng)[13,17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的lncRNA ANRIL可通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子陰陽(yáng)1(Yin-Yang 1, YY1)形成功能性復(fù)合物，從而促進(jìn)NF-κB下游炎癥基因IL-6和IL-8的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CAD的炎癥反應(yīng)[18]。這些研究提示，lncRNA ANRIL對(duì)炎癥的調(diào)控具有雙向性。此外，lncRNA ANRIL在腦卒中組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)與CAD高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[13,19-21]。研究也發(fā)現(xiàn)，頸動(dòng)脈硬化斑塊lncRNA ANRIL的表達(dá)量與頸動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度正相關(guān)[21]。由此可見(jiàn)，lncRNA ANRIL的表達(dá)水平與一些炎性疾病的發(fā)生和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。鑒于銀屑病是一種以皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖、分化和持續(xù)的皮膚炎癥為特點(diǎn)的慢性疾病，推測(cè)lncRNA ANRIL的表達(dá)水平與銀屑病的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。筆者評(píng)估了銀屑病患者病變皮膚組織和配對(duì)正常皮膚組織中l(wèi)ncRNA ANRIL的表達(dá)量，結(jié)果顯示，lncRNA ANRIL在銀屑病患者的病變皮膚組織中的表達(dá)量顯著高于正常皮膚組織，ROC曲線結(jié)果也顯示，lncRNA ANRIL表達(dá)量可以較好地區(qū)分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織。此外，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，lncRNA ANRIL表達(dá)量與銀屑病的疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)，進(jìn)一步的多元線性回歸分析表明，病變皮膚組織lncRNA ANRIL高表達(dá)與患者更高疾病嚴(yán)重程度獨(dú)立相關(guān)。這些結(jié)果可能的原因是：(1)lncRNA ANRIL可能通過(guò)多種途徑參與銀屑病的炎癥，如通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB途徑增加促炎因子IL-6和IL-8的表達(dá)水平，從而促進(jìn)銀屑病的炎癥反應(yīng)，因此其在銀屑病的病變皮膚組織中高表達(dá)并與更高的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[18]。(2)lncRNA ANRIL在銀屑病中的作用可能與其在癌癥中的作用相似，可以通過(guò)促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖，抑制角質(zhì)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致銀屑病角質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖，因此lncRNA ANRIL在銀屑病病變組織中高表達(dá)，患者表現(xiàn)更高的疾病嚴(yán)重程度[15]。(3)lncRNA ANRIL可能通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞耐藥的方式來(lái)促進(jìn)銀屑病的進(jìn)展[16]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，受累BSA較大和接受局部治療同樣與患者更重的疾病嚴(yán)重程度獨(dú)立相關(guān)，可能是因?yàn)槭芾跙SA是PASI評(píng)分中的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，因此，受累BSA越大PASI評(píng)分越高；至于局部治療，可能是因?yàn)檫@種治療方式效果不明顯，疾病控制度差，因此PASI評(píng)分高。

表4 影響PASI評(píng)分的線性回歸分析

B：非標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)；Beta：標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)；PASI：銀屑病皮損面積及嚴(yán)重度指數(shù)；lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；ANRIL：INK4位點(diǎn)的反義非編碼RNA；BMI：體質(zhì)量指數(shù)；BSA：體表面積；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素.

表5病變皮膚組織lncRNA ANRIL相對(duì)表達(dá)量和炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的關(guān)聯(lián)

Tab 5Association between lncRNA ANRIL relative expression of psoriatic lesions and relative expression of inflammatory cytokine mRNA

炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量相關(guān)系數(shù)rP值TNF-α0.248<0.001IL-60.2190.002IL-80.0650.355IL-170.252<0.001IL-220.0970.169

lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；ANRIL：INK 4位點(diǎn)的反義非編碼RNA；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素.

為進(jìn)一步確定lncRNA ANRIL與銀屑病炎癥的關(guān)系，本研究檢測(cè)了銀屑病患者病變皮膚組織中的幾個(gè)炎癥因子mRNA的表達(dá)水平，并與lncRNA ANRIL在病變皮膚組織中的表達(dá)量做了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，銀屑病病變皮膚組織中l(wèi)ncRNA ANRIL水平與TNF-α、IL-6和IL-17水平正相關(guān)，表明lncRNA ANRIL可能是通過(guò)促進(jìn)患者的炎癥來(lái)加重患者的疾病嚴(yán)重程度。這可能與其在CAD中的促炎作用相同，lncRNA ANRIL通過(guò)調(diào)控多種通路，如誘導(dǎo)NF-κB途徑激活來(lái)促進(jìn)NF-κB下游的促炎因子TNF-α，IL-6和IL-17的表達(dá)[18]。

此外，本研究還存在一些局限性：(1)本研究為單中心研究，可能存在選擇偏倚；(2)本研究樣本量較小，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)效能較低；(3)本研究未評(píng)估lncRNA ANRIL在銀屑病治療中的作用，這需要在將來(lái)研究中進(jìn)一步探索。

綜上所述，lncRNA ANRIL表達(dá)水平在銀屑病病變皮膚組織中高表達(dá)，且與銀屑病患者疾病嚴(yán)重程度及炎癥因子水平正相關(guān)。