唾液酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的抗氧化作用

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(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,北京 100191;2.食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191;3.中科鴻基生物科技有限公司,山西晉中 031100)

唾液酸又稱燕窩酸,現(xiàn)代研究證明唾液酸含量可占燕窩干重的7%～15%左右[1],是燕窩的重要特征成分[2],最初從牛頜下腺黏蛋白中分離而出,由此得名。唾液酸是一類九碳單糖的衍生物,也是所有神經(jīng)氨酸或酮基-脫氧壬酮糖酸(KDN)的N-或O-衍生物總稱[3],位于細(xì)胞膜糖蛋白側(cè)鏈末端,是細(xì)胞膜表面受體的重要組成部分[4]。目前已經(jīng)有很多唾液酸生物學(xué)功能的研究,其中以N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac,NANA)的研究居多。

唾液酸具有多種的生理功能,如外源性唾液酸的添加可以改善子代學(xué)習(xí)記憶[5-6]、減輕動(dòng)脈粥樣硬化[7]、預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥[8]等;內(nèi)源性唾液酸可以用來預(yù)測(cè)和評(píng)估人類疾病潛在風(fēng)險(xiǎn)[9-11]等,此外有研究發(fā)現(xiàn)唾液酸可能具有抗氧化功能。何培元等[12]通過手術(shù)摘除大鼠卵巢誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激,利用燕窩調(diào)節(jié)肝細(xì)胞抗氧化通路中相關(guān)基因SOD 1/2/3及PARP 1的mRNA表達(dá),發(fā)揮抗氧化作用,進(jìn)而保護(hù)肝細(xì)胞,基于唾液酸在燕窩中重要功能特性原因,推測(cè)燕窩調(diào)節(jié)抗氧化功能可能與其中的唾液酸有關(guān)。此外研究表明NANA可作為抗氧化劑與H2O2反應(yīng),產(chǎn)生H2O與無毒羧酸,且不會(huì)產(chǎn)生氧自由基[13]。該反應(yīng)在體內(nèi)任何pH環(huán)境下都有可能發(fā)生,在pH大于5時(shí),H2O2的濃度下降速度更快[14]。同時(shí)在肥胖相關(guān)疾病的研究中發(fā)現(xiàn),NANA可以預(yù)防高脂膳食誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[7-8]。目前關(guān)于對(duì)唾液酸改善乙醇所致的氧化損傷尚未見報(bào)道,無對(duì)于唾液酸抗氧化能力的劑量反應(yīng)關(guān)系的相關(guān)研究。

為進(jìn)一步探索唾液酸對(duì)乙醇所致氧化損傷的改善作用以及其最佳作用劑量,本研究以ICR小鼠建立急性酒精肝損傷的動(dòng)物模型,探索唾液酸對(duì)小鼠氧化應(yīng)激的保護(hù)作用,并初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

唾液酸(純度≥98.0%,CAS:131-48-6) 中科鴻基生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)測(cè)試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測(cè)試盒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)測(cè)試盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測(cè)試盒、蛋白質(zhì)羰基(Protein Carbonyl,PC)試劑盒、蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所;SPF級(jí)ICR雄性小鼠(50只,體重(25.0±5.0) g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXX(京)2016-0010,6～7周齡)、飼料 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

SPN3001F電子分析天平 奧豪斯;FLUO star Omega多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BMG LABTECH公司;BFX5-320型低溫自動(dòng)平衡離心機(jī) 北京白洋離心機(jī)廠;Allegra X-30R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)BECKMAN COULTER公司;HH·S11-1電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 小鼠給予維持飼料,光/暗周期12 h/12 h(光照時(shí)間07:00～19:00),室內(nèi)溫度為(23±2) ℃,濕度為50%～60%,50只雄性ICR小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,稱重,按體重隨機(jī)分為5組,分別為空白對(duì)照組、模型組、唾液酸低、中、高劑量組(低劑量組:15 mg/kg·bw;中劑量組:30 mg/kg·bw;高劑量組:60 mg/kg·bw),每組各10只。各組均給予維持飼料,自由進(jìn)食、飲用無菌去離子水。

1.2.2 造模及給藥方法 實(shí)驗(yàn)期間每天上午8:00～10:00對(duì)各劑量組進(jìn)行灌胃,給予不同劑量的受試樣品,對(duì)照組和模型組經(jīng)口灌胃雙蒸水,灌胃容量為0.1 mL/10 g,并根據(jù)體重來調(diào)整灌胃劑量,灌胃期間自由取食和飲水。連續(xù)30 d灌胃并每隔5 d記錄體重和攝食量。末次灌胃后,模型組和3個(gè)劑量組禁食16 h(過夜),然后一次性灌胃給予50%乙醇12 mL/kg·bw,6 h后取材(空白對(duì)照組不作處理)。每5 d在同一時(shí)間上午10:00記錄體重與食物消耗量,并計(jì)算食物利用率。

食物利用率(%)=體重增加量×100/鼠糧消耗量

1.2.3 測(cè)試樣品的制備和檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃乙醇6 h后,摘眼球取血,3000 r/min離心10 min(用于測(cè)血清SOD、GSH-Px、GSH和MDA)。

斷頸處死后取肝組織在預(yù)冷的0.9%生理鹽水中漂洗,洗凈組織表面血跡,并用濾紙吸干水分。稱重后放入10 mL離心管中,加入體積是肝組織重量9倍的冷0.9%生理鹽水,用眼科小剪刀迅速剪碎組織,冰水浴組織搗碎機(jī)制備組織勻漿液,4 ℃下3000 r/min離心10 min,取上清進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定 SOD和GSH-Px活性,GSH、MDA、蛋白質(zhì)羰基和總蛋白含量指標(biāo)檢測(cè)參照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較組間差異,以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。方差齊時(shí),采用LSD法進(jìn)行兩兩比較;方差不齊時(shí),采用Tamhane’s法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化

由圖1、表1可知,適應(yīng)性喂養(yǎng)后各組動(dòng)物的初始體重?zé)o明顯差異,體重隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,同時(shí)各組小鼠的食物利用率無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)中小鼠體重由30 g左右增長(zhǎng)至35 g左右,小鼠體重增長(zhǎng)緩慢,增重率逐漸下降,在飼料消耗量一直保持穩(wěn)定的趨勢(shì)下,食物利用率處于降低趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠無異常表現(xiàn),表明唾液酸在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠無毒性作用,對(duì)其正常生長(zhǎng)發(fā)育無影響。

圖1 唾液酸對(duì)小鼠體重的影響Fig.1 Effects of sialic acid on the weight of mice

表1 唾液酸對(duì)小鼠食物利用率的影響Table 1 Effects of sialic acid on food utilization rate of mice

注:與空白對(duì)照組相比,*代表顯著差異P<0.05,**代表極顯著差異P<0.01;與模型對(duì)照組相比#代表顯著差異P<0.05,##代表極顯著差異P<0.01;表2～表6同。

2.2 唾液酸對(duì)小鼠SOD活力的影響

小鼠血清和肝臟中SOD活力結(jié)果見表2。與空白對(duì)照組相比,模型組血清和肝臟中SOD活性均顯著降低(P<0.01),表明實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組相比,中劑量組血清和肝臟中SOD活性均提升顯著(P<0.05)。

表2 唾液酸對(duì)小鼠抗氧化酶SOD活力的影響Table 2 Effects of sialic acid on activity of SOD in mice

2.3 唾液酸對(duì)小鼠GSH-Px活力的影響

由表3可知,與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠血清中GSH-Px活性顯著降低(P<0.05),肝臟中極顯著降低(P<0.01),表明實(shí)驗(yàn)造模成功。在血清中高劑量組較模型組酶活性提升顯著(P<0.01),但肝臟中各劑量組GSH-Px活力較模型組未見顯著差異(P>0.05)。

表3 唾液酸對(duì)小鼠抗氧化酶GSH-Px活力的影響Table 3 Effects of sialic acid on activity of GSH-Px in mice

2.4 唾液酸對(duì)小鼠GSH 含量的影響

如表4所示,模型組血清和肝組織中GSH的含量顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01),表明造模成功;唾液酸各劑量組小鼠血清中GSH含量均顯著高于模型組(P<0.05),但在肝臟中,各劑量組GSH含量較之模型組未見顯著差異(P>0.05)。

表4 唾液酸對(duì)小鼠GSH含量的影響Table 4 Effects of sialic acid on the content of GSH in mice

2.5 唾液酸對(duì)小鼠MDA含量的影響

由表5可知,與空白對(duì)照組相比,模型組血清和肝臟中MDA含量極顯著增加(P<0.01),表明實(shí)驗(yàn)造模成功。血清中唾液酸中、高劑量組MDA 含量極顯著低于模型組(P<0.01),而肝臟中,各劑量組相對(duì)于模型組MDA有所降低,但未見顯著差異(P>0.05)。

表5 唾液酸對(duì)小鼠MDA含量的影響Table 5 Effects of sialic acid on MDA in mice

2.6 唾液酸對(duì)小鼠肝組織PC含量的影響

由表6可知,模型組小鼠肝臟中PC含量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01),表明實(shí)驗(yàn)造模成功。唾液酸各劑量組小鼠肝臟中PC含量均低于模型組,但僅中劑量組含量顯著降低(P<0.05)。

表6 唾液酸對(duì)小鼠蛋白質(zhì)羰基含量的影響Table 6 Effects of sialic acid on PC content in mice

3 討論與結(jié)論

本研究以小鼠機(jī)體非酶系抗氧化物GSH含量、抗氧化酶系SOD、GSH-Px活性及氧化損傷典型產(chǎn)物PC和MDA含量為檢測(cè)指標(biāo),探究唾液酸對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果顯示模型組較空白組SOD、GSH-Px酶活性、GSH含量顯著降低,PC及MDA含量顯著提升,表明本實(shí)驗(yàn)急性肝損傷小鼠造模成功。唾液酸劑量組較模型組,GSH、GSH-Px(給藥60 mg/kg·bw唾液酸)及MDA在血清中表現(xiàn)出了顯著性差異,給藥30 mg/kg·bw唾液酸后PC含量在肝組織中顯著降低,而給藥30 mg/kg·bw唾液酸后抗氧化酶系SOD在血清和肝組織中均有顯著提升,表明受試物唾液酸具有保護(hù)抗氧化損傷作用。

機(jī)體在急性酒精暴露下,活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加或抗氧化酶活性降低。ROS如超氧陰離子自由基、羥基自由基和H2O2在能量轉(zhuǎn)換過程中不斷產(chǎn)生,同時(shí)生物體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[15]。受試物對(duì)急性酒精誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠的保護(hù)作用可能是通過提升小鼠體內(nèi)抗氧化酶系活性、清除體內(nèi)自由基、降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量等途徑實(shí)現(xiàn)的。

GSH與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和GSH-Px結(jié)合,在細(xì)胞對(duì)ROS的防御機(jī)制中起著十分重要的作用[17]。本研究結(jié)果中唾液酸各干預(yù)組GSH含量均有顯著提升,表明唾液酸對(duì)于酒精誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激保護(hù)作用可能是由于GSH氧化還原平衡調(diào)節(jié)的結(jié)果,推測(cè)唾液酸在保護(hù)細(xì)胞免受ROS施加的自由基應(yīng)激中起到關(guān)鍵作用。

相關(guān)研究表明酒精的大量攝入會(huì)改變體內(nèi)的脂質(zhì)平衡并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA的大量生成[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明唾液酸中、高劑量組血清中MDA含量較模型組均有顯著降低。相關(guān)研究證實(shí)NANA可以通過與H2O2反應(yīng)的相同方式降低脂質(zhì)氫過氧化物的細(xì)胞毒性[19]。何培元等12]實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中作為燕窩重要功能成分的唾液酸結(jié)論相符。此外,PC含量也是氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志之一,是評(píng)估細(xì)胞氧化損傷程度及衡量自由基對(duì)機(jī)體的損傷的重要手段[20]。本實(shí)驗(yàn)中唾液酸中劑量組PC含量較之模型組顯著降低,推測(cè)唾液酸可以通過與自由基結(jié)合保護(hù)機(jī)體中蛋白質(zhì),避免酒精急性氧化應(yīng)激造成的分子羰基化修飾。

不同劑量的唾液酸干預(yù)對(duì)抗氧化劑及氧化應(yīng)激產(chǎn)物的作用呈現(xiàn)出不同效果,提示唾液酸干預(yù)可以在一定程度上整體改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平,而這種改善效應(yīng)具有一定的劑量依賴性。中劑量組的抗氧化防御效果最好。但未能觀察到顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。因此推測(cè)一定劑量的唾液酸干預(yù)具有抗氧化作用,但存在適宜的劑量范圍。

本研究通過聚焦外源性唾液酸的補(bǔ)充對(duì)于氧化應(yīng)激的保護(hù)作用,為唾液酸保肝護(hù)肝相關(guān)功能性產(chǎn)品開發(fā)提供新思路,目前本研究還存在著許多問題,需要進(jìn)一步開展深入的機(jī)制研究,以探索其具體改善氧化損傷介導(dǎo)的肝損傷機(jī)制。此外,仍需進(jìn)一步的人群實(shí)驗(yàn),開展相關(guān)干預(yù)性研究,以驗(yàn)證唾液酸的保肝護(hù)肝功能。