PRiME HLB固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時快速測定雞蛋中48種獸藥殘留

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心,廣西南寧 530021)

為了預(yù)防和治療禽類各種疾病、促進(jìn)禽類生長、降低死亡率,獸藥被廣泛用于禽類及其產(chǎn)品。但由于在獸藥使用過程中濫用、誤用以及不遵守休藥期等現(xiàn)象屢禁不止,造成獸藥藥物及其代謝產(chǎn)物在禽蛋中殘留,超標(biāo)的現(xiàn)象時有發(fā)生,嚴(yán)重影響公眾的健康[1-2]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號明確規(guī)定了食品動物禁用的一系列藥物,并制定了這類藥物最高殘留限量(MRLs)[3],其中激素類、氯霉素類、喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類是禁限用藥物;喹乙醇代謝物、吩噻嗪類、苯二氮卓類、四環(huán)素類、吡啶類、青霉素類、頭孢類獸藥是禽類常用且容易濫用的藥物[4]。因此,建立一種快速、簡便、靈敏、可靠、可同時檢測食品中多類獸藥殘留的檢測方法十分必要。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高的靈敏度、選擇性以及分離能力,已成為同時檢測復(fù)雜動物組織樣品中多類獸藥殘留極其重要的分析方法[5-6]。但這些方法只能同時檢測獸藥中的2～4類,同時快速測定上述14類藥物在雞蛋中殘留量檢測方法報道甚少。在我國農(nóng)業(yè)部235號公告對禽蛋制定的18種殘留限量中,僅制定了禽蛋中哌嗪、樂泰菌素、林可霉素、大觀霉素4種獸藥的檢測標(biāo)準(zhǔn)?；前奉愇镔|(zhì)按《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB/T 20759-2006)檢測,而此標(biāo)準(zhǔn)僅適用于牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和兔肉,并未提及禽蛋[7]。《綠色食品 蛋與蛋制品》(NY/T 754-2011)中要求四環(huán)素、金霉素和土霉素按《動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》(GB/T 21317-2011)測定,而此標(biāo)準(zhǔn)僅適用于動物肌肉、內(nèi)臟組織、水產(chǎn)品、牛奶,也未提及禽蛋。我國對于禽蛋中獸藥殘留的檢測相關(guān)報道甚少,只涉及到氯霉素、甲硝唑、硝基呋喃類和喹諾酮類藥物[8-9]。由此可看出我國禽蛋中獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)尚不全面,部分蛋禽養(yǎng)殖過程普遍使用的獸藥沒有制定殘留限量標(biāo)準(zhǔn),部分獸藥殘留限量值的設(shè)定仍需探究;同時制定殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的獸藥缺乏相應(yīng)的檢測方法[10-11]。因此,開發(fā)建立禽蛋中獸藥殘留的檢測方法,考究禽蛋中獸藥殘留的種類,加強(qiáng)我國禽蛋獸藥殘留的風(fēng)險評估,對于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中獸藥最大殘留限量及相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的制修訂工作具有重要意義,為食品安全監(jiān)管工作提供重要的技術(shù)支撐[12]。

前處理采用PRiME HLB一步法[13-14]提取和凈化雞蛋樣品,前處理簡單,并且基質(zhì)干擾較小、靈敏度較高,能得到較為滿意的效果。Oasis PRiME HLB固相小柱是在Oasis HLB固相小柱技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的新一代反相固相萃取吸附劑,可以有效地吸附樣品中蛋白質(zhì)和磷脂類物質(zhì),較以往固相萃取劑具有更簡單、更快速、更潔凈的優(yōu)勢[15-16]。因此本研究采用PRiME HLB固相萃取前處理樣品,結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測,建立了同時測定雞蛋中磺胺及其增效劑類(10種)、喹諾酮類(9種)、硝基咪唑類(5種)、喹乙醇代謝物(1種)、氯霉素類(3種)、吩噻嗪類(1種)、苯二氮卓類(1種)、大環(huán)內(nèi)酯類(5種)、四環(huán)素類(4種)、吡啶類(1種)、青霉素類(4種)、頭孢類(2種)、激素類(1種)、抗病毒類(1種)共14類48種獸藥殘留的新方法,為禽類及其產(chǎn)品中殘留獸藥的分析提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 均來自廣西多個地市(包括南寧市、桂林市、柳州市、百色市等11個地區(qū))共82批,所有雞蛋樣品均取可食用部分,絞碎均質(zhì)后,-20 ℃冷凍保存,待檢測;磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺地索辛、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、甲氧芐啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、洛美沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、司帕沙星、地美硝唑、甲硝唑、洛硝噠唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、3-甲基噁喹啉-2-羧酸、氯丙嗪、地西泮、林可霉素、替米考星、紅霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、氯羥吡啶、阿莫西林、氨芐青霉素、芐青霉素、鄰氯青霉素、頭孢氨芐、頭孢唑啉、地塞米松、金剛烷胺、氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品 純度均大于90.0%,德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈 色譜純,德國默克公司;乙酸銨 色譜純,美國Tedia公司;甲酸 分析純,廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心;所用水 超純水。

PRime HLB固相萃取小柱(6cc,500 mg)、MCX陽離子交換柱(6cc,150 mg) 美國Waters公司;QTRQ AP4500串聯(lián)四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀 美國AB公司;Milli-Q Advantage A10超純水機(jī) 德國Millipore公司;PGC753e型電子天平 艾德姆衡器(武漢)有限公司;Multi Reax型全自動振蕩器 Heidolph公司;X3R型高速冷凍離心機(jī) Thermo公司;Genius NM32LA型氮?dú)獍l(fā)生器 PEAK公司;ATR Autovap S60型多樣品自動濃縮儀 力德生物科技(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 稱取樣品約2.50 g(精確到0.01 g)于50 mL聚酯離心管中,用90%乙腈水溶液定容至10.0 mL,劇烈振蕩10 min后,10000 r/min冷凍離心5 min。取上清液約5 mL,加入固相小柱內(nèi)(Oasis PRiME HLB,500 mg,6cc,無需活化),保持1 s/滴,收集流出液到4.0 mL,40 ℃氮吹至小于0.5 mL,用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL,渦旋2 min,10000 r/min離心5 min,取上清液,過0.22 μm濾膜,即可[17]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取48種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約10 mg,用乙腈溶解并定容至10 mL,制成1 g/L的單標(biāo)儲備液。分別吸取0.1 mL至同一100 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取2.50 g雞蛋樣品空白基質(zhì),分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.1方法處理樣品,制得質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、20、50 μg/kg的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中48種獸藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。

1.2.3 色譜條件 正離子模式液相色譜條件:色譜柱CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H(3 μm,2.0×100 mm),流動相A為0.1%甲酸水、B為0.05%甲酸乙腈。梯度洗脫程序如表1所示,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣體積20 μL,色譜柱溫度35 ℃。

表1 正離子梯度洗脫程序Table 1 Cation gradient elution procedure

負(fù)離子模式液相色譜條件:色譜柱ACQUITY UPLC? BEH C18(1.8 μm,2.1×50 mm),流動相C為5 mmol/L乙酸銨、流動相D為乙腈。梯度洗脫程序如表1所示:正離子的流速0.3 mL/min,進(jìn)樣體積20 μL,色譜柱溫度45 ℃。負(fù)離子的流速0.3 mL/min,進(jìn)樣體積20 μL,色譜柱溫度35 ℃。

表2 負(fù)離子梯度洗脫程序Table 2 Anion gradient elution procedure

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI),多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);正離子掃描模式:電噴霧電壓(IS)5500 V;離子源溫度(TEM)550 ℃;氣簾氣(CUR)流速35 L/min;霧化氣(GS1)流速55 L/min;輔助加熱氣(GS2)流速55 L/min;射入電壓(EP)10 V。負(fù)離子掃描模式:電噴霧電壓(IS)-4500 V;離子源溫度(TEM)550 ℃;氣簾氣(CUR)流速35 L/min;霧化氣(GS1)流速50L/min;輔助加熱氣(GS2)流速50 L/min;射入電壓(EP)-10 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用MultiQuant 3.0.2分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜離子源參數(shù)的優(yōu)化

本研究測定的目標(biāo)化合物種類較多,極性相差大,在質(zhì)譜中的響應(yīng)差別也較大,有必要對質(zhì)譜中信號響應(yīng)較小的化合物進(jìn)行離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。分別選擇羥甲基甲硝咪唑、紅霉素、甲砜霉素對正、負(fù)離子源條件進(jìn)行優(yōu)化。將流動相與標(biāo)準(zhǔn)溶液注射泵鏈接,同時將流動相與標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中,分別調(diào)節(jié)質(zhì)譜的電噴霧電壓(IS)、離子源溫度(TEM)、氣簾氣(CUR)流速、霧化氣(GS1)流速、輔助加熱氣(GS2)流速[19-22]。得到化合物響應(yīng)最大時的離子源條件見1.2.4,48種獸藥的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表3。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 分別對CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H(3 μm,2.0×100 mm)、Waters ACQUITY UPLC? BEH C18(1.7 μm,2.0×150 mm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(1.8 μm,2.1×150 mm)、Phenomenex Kinetex XB-C18(1.7 μm,2.1×100 mm)4種不同型號色譜柱對相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液掃描分析,考察其保留時間和分離效果[23-24]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四根柱子中CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H(3 μm,2.0×100 mm)測定正離子項目組分保留時間明顯縮短,分離度更好,而ACQUITY UPLC? BEH C18(1.7 μm,2.0×150 mm)測定負(fù)離子項目組分的峰型更尖銳,靈敏度更高,因此選用上述兩種色譜柱分別對正離子和負(fù)離子進(jìn)行測定。

2.2.2 流動相的選擇 在流動相系統(tǒng)選擇中,為了使目標(biāo)物和干擾物達(dá)到分離,分別使用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液(負(fù)離子)等多種流動相系統(tǒng)進(jìn)行試驗,以采用乙腈-0.1%甲酸水溶液檢測正離子質(zhì)譜的分離度和響應(yīng)值最高,而采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液檢測負(fù)離子質(zhì)譜的分離度和響應(yīng)值較高。所以采用多反應(yīng)監(jiān)測模式分開對正、負(fù)離子進(jìn)行測定,使離子對試劑在質(zhì)譜檢測器中響應(yīng)提高。梯度洗脫時,通過改變流動相的比例,使48種殘留藥物都分離出來,待測組分保留時間重現(xiàn)性好,靈敏度高。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇 雞蛋中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪,因此在提取過程中,需要考慮沉淀蛋白和去除脂肪[25]。常見的提取劑為乙腈,乙腈同時還具有沉淀蛋白的作用,所以選擇乙腈作為提取溶劑[26]。本研究比較了70%乙腈、80%乙腈、90%乙腈、100%乙腈、含1%甲酸乙腈溶液5種溶劑,發(fā)現(xiàn)70%乙腈、80%乙腈在過柱時容易堵塞凈化柱,可能因為溶劑水分比較高,導(dǎo)致沉淀蛋白和去除脂肪能力減弱,同時水分含量高,在氮吹濃縮步驟時去除水分更為繁瑣費(fèi)時;含1%甲酸乙腈可以較好的沉淀樣品中的蛋白質(zhì),但對一些堿性化合物如磺胺類回收率偏低;90%乙腈與100%乙腈比較,發(fā)現(xiàn)90%乙腈提取回收率較高,峰形較好,故采用90%乙腈進(jìn)行提取,提取溶劑考察數(shù)據(jù)對比見圖1。

圖1 提取溶劑考察數(shù)據(jù)對比圖Fig.1 Comparison of extraction solvent investigation data

表3 48種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometric parameters of 48 veterinary drugs

2.3.2 固相萃取柱的選擇 樣品直接提取液含大量雜質(zhì)如脂肪和磷脂類等物質(zhì),所以選擇經(jīng)過固相萃取柱來盡可能凈化樣品溶液[27],本研究通過對waters HLB固相小柱和MCX陽離子交換固相萃取小柱進(jìn)行加標(biāo)回收比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HLB固相萃取過柱時比較容易堵塞凈化柱,回收率低,偏差較大,而使用陽離子交換柱的檢測響應(yīng)值明顯偏低。PRiME HLB為新型固相HLB處理小柱,屬于過濾性除去雜質(zhì)固相小柱,能有效的去除樣品中的蛋白質(zhì)、磷脂類干擾物質(zhì),本研究比較了未使用PRiME HLB凈化(圖2)和使用PRiME HLB凈化(圖3)的樣品,在母離子質(zhì)荷比為431和子離子質(zhì)荷比為184條件下,對磷脂中的主要成分磷脂酰膽堿進(jìn)行檢測,結(jié)果表明PRiME HLB小柱能去除大部分的磷脂。選用PRiME HLB前處理過程更加快速、高效、靈敏,能滿足雞蛋中48種藥物殘留的分析檢測要求,所以選用PRiME HLB進(jìn)行凈化[28]。

圖2 未使用PRiME HLB凈化樣品的磷脂酰膽堿離子流圖Fig.2 Ion chromatogram of thepurified sample without PRiME HLB

圖3 使用PRiME HLB凈化后樣品磷脂酰膽堿離子流圖Fig.3 Ion Chromatogram of thepurified sample using PRiME HLB

2.3.3 定容溶劑的選擇 分別用10%乙腈、20%乙腈、30%乙腈、50%乙腈、100%乙腈定容上機(jī)考察,實驗發(fā)現(xiàn)使用100%乙腈、20%、30%、50%乙腈定容時多數(shù)目標(biāo)物的峰型變寬,當(dāng)用10%乙腈定容時峰型尖銳,因此選擇10%乙腈為定容溶劑。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

按1.2.2配制6個水平的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在選定的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)下進(jìn)行檢測。以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線,48種獸藥的線性范圍為0.5～50 μg/kg,相關(guān)系數(shù)r為0.9952～1.0000,線性良好。以定量離子信噪比S/N=3為樣品的檢出限,S/N=10為定量限,結(jié)果見表4。48種獸藥的檢出限為0.01～0.55 μg/kg,定量限為0.03～1.83 μg/kg。

2.5 回收率和精密度

在優(yōu)化條件下采用空白雞蛋基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收率及精密度試驗,樣品添加水平分別為1、5和50 μg/kg,分別對每個添加水平進(jìn)行平行測試3次,計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(見表5)。各化合物的回收率為63.3%～111.4%,符合多殘留分析的要求。圖4、圖5為50 μg/kg 添加水平下,雞蛋中目標(biāo)化合物的正、負(fù)離子流色譜圖。

圖4 雞蛋中45種獸藥的正離子流圖Fig.4 Positive ion flow diagram of 45 veterinary drugs in eggs

圖5 雞蛋中3種獸藥的負(fù)離子流圖Fig.5 Anion flow diagram of three veterinary drugs in eggs

表4 雞蛋中48種獸藥殘留的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限Table 4 Linear equation,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 48 veterinary drug residues in eggs

表5 雞蛋中48種獸藥殘留加標(biāo)回收率及精密度(n=3)Table 5 The adding standard recovery rate and accuracy degree of 48 veterinary drugs in eggs(n=3)

2.6 實際樣品測定

采用本研究方法對廣西11個地市共82批次雞蛋進(jìn)行獸藥殘留篩查,檢出10項目標(biāo)化合物,針對檢出的10種化合物,采用法定標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21316-2007、GB/T 21312-2007、GB/T 21318-2007、SN/T 1777.2-2007、GB 29699-2013、SN/T 4253-2015、GB/T 22338-2008對檢出項目進(jìn)行測定,對本研究方法測得結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法測得結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)本研究方法測得結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法測得結(jié)果基本一致,表明本研究方法數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。結(jié)果見表6。

本文采用改進(jìn)的Oasis PRiME HLB方法,建立了LC-MS/MS同時測定雞蛋中磺胺類及其增效劑、喹諾酮類、硝基咪唑類、喹乙醇代謝物、氯霉素類等14類48種獸藥殘留分析方法。與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相比,本方法可以同時分析多類獸藥殘留,簡單快速,縮短了檢驗周期,節(jié)約了檢驗的成本。本方法操作簡單,凈化效果好,靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度符合多獸殘檢測技術(shù)的要求,為各食品檢測機(jī)構(gòu)提供簡單快速的方法來應(yīng)對大批量的雞蛋樣品中禁限用獸藥的日常監(jiān)管,為保證人民飲食安全提供了技術(shù)支持。

表6 本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法測得值比較Table 6 Comparison of measured valuesbetween the test and the GB method