植物油中維生素E異構(gòu)體在C18和CSH Fluoro-Phenyl固定相上的保留特征及含量差異

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(1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶 400067;2.重慶第二師范學(xué)院,脂質(zhì)資源與兒童日化品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400067;3.重慶江源油橄欖開(kāi)發(fā)有限公司,重慶 401587;4.蘭州海關(guān)綜合技術(shù)中心,甘肅蘭州 730000)

維生素E(Vitamin E,VE)是一種脂溶性維生素,是目前食品行業(yè)中最主要的抗氧化劑之一。VE不僅能有效抑制油脂氧化、防止油脂酸敗變質(zhì),而且具有防癌、抗衰老等功效[1-3]。根據(jù)甲基的數(shù)目和位置的不同,天然維生素E分為α-VE、β-VE、γ-VE和δ-VE4種同分異構(gòu)體,其中α-VE生理活性最強(qiáng),β-和γ-VE次之,δ-VE幾乎沒(méi)有活性[4]。有研究表明,不同種類植物油中VE含量有較大差異,可作為植物油類別的指紋圖譜用于植物油的鑒別和質(zhì)量控制[1,5]。因此,如何快速、準(zhǔn)確分析測(cè)定植物油中VE的種類及含量,對(duì)油脂摻偽、品質(zhì)評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制至關(guān)重要。

表1 色譜柱信息及流動(dòng)相Table 1 Mobile phase and information of columns

關(guān)于植物油中VE組分及其含量的研究報(bào)道較多,包括電化學(xué)法[6-7]、熒光光譜法[8-9]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、超臨界流體色譜法[11-12]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13],由于反相液相色譜-熒光檢測(cè)法具有較高的穩(wěn)定性、靈敏度以及較低的檢測(cè)成本,目前已成為VE分離分析的主流方法[14-16]。在眾多相關(guān)研究中,未見(jiàn)對(duì)VE異構(gòu)體在不同固定相上的保留特征參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性的研究,這在一定程度上限制了VE在不同固定相上色譜保留的特征,以及進(jìn)一步對(duì)VE組分進(jìn)行有效的分離檢測(cè)。為了更準(zhǔn)確的對(duì)VE異構(gòu)體進(jìn)行分離及定量,本文基于超高效液相色譜-熒光檢測(cè)器,系統(tǒng)研究了不同固定相(BEH C18以及CSH FL色譜柱)對(duì)四種VE異構(gòu)體的分離效果;通過(guò)對(duì)四種VE異構(gòu)體的保留時(shí)間(Retention time,tR),分離度(Resolution,R)、拖尾因子(Tailing factor,Tf)以及容量因子(Capacity factor,k)作為指標(biāo)對(duì)其保留特征進(jìn)行討論,而后對(duì)柱溫、流動(dòng)相及流速等色譜參數(shù)的優(yōu)化,建立了一種高效、靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定不同的VE異構(gòu)體測(cè)定方法,以期為VE的異構(gòu)體在不同固定相上的保留特征以及植物油的鑒別和質(zhì)量控制提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

初榨橄欖油(O1-O13)、調(diào)和油(T1-T2)、牡丹籽油(M1)、葵花籽油(K1)、大豆油(D1)、菜籽油(C1)、胡麻油(H1-H3)、芝麻油(Z1) 所有植物油樣品均購(gòu)自本地超市,樣品避光冷藏保存;標(biāo)準(zhǔn)品α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE純度>95%) 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇 均為色譜純;其余試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

Acquity UHPLC儀配熒光檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司;MS3渦旋儀 德國(guó)IKA公司;3K30冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司;分析天平(±0.1 mg) 德國(guó)Sartorius公司;移液槍(100～1000、20～100 μL) 美國(guó)Thermo Electron公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)貯備液:分別精確稱取α-VE、β-VE、γ-VE和δ-VE各5.00 mg,用乙腈溶液準(zhǔn)確定容至100 mL容量瓶中,配制成50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃冷藏待用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.2、2.0、10.0、20.0 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液至100 mL容量瓶中,乙腈準(zhǔn)確定容,配制成0.1,1.0,10.0和20.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液;然后再分別準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液10.0、5.0和2.0 mL至100 mL容量瓶中,配制成0.01,0.005和0.002 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液,4 ℃下冷藏待用。

1.2.2 樣品處理 稱取1.00 g樣品于50 mL聚乙烯管中,加入20 mL乙醇溶液,渦旋2.0 min,放置-20 ℃冰箱冷凍15 min,然后置于2 ℃冷凍離心機(jī)中以10000 r/min離心5 min,取上清液1.5 mL,經(jīng)0.22 μm有機(jī)相膜過(guò)濾后進(jìn)樣。整個(gè)處理過(guò)程避光進(jìn)行。

1.2.3 UPLC色譜條件 色譜柱信息見(jiàn)表1;熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為300 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為330 nm;柱溫30 ℃,進(jìn)樣量為1.0 μL;流動(dòng)相A為乙腈或甲醇;流動(dòng)相B為水,等度洗脫;使用Empower軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

為了深入研究維生素E異構(gòu)體在不同固定相上的保留特征,本研究以四種VE異構(gòu)體在不同固定相上的tR,R、Tf以及k的變化為指標(biāo),評(píng)價(jià)VE異構(gòu)體的色譜保留特征。

2.1 BEH C18固定相下不同流動(dòng)相及溫度對(duì)異構(gòu)體保留特征的影響

傳統(tǒng)C18色譜柱由于鍵合技術(shù)及是否封尾從而直接影響色譜分離的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、pH范圍以及極性和/或堿性化合物的保留。亞乙基橋雜化(Ethylene Bridged Hybrid,BEH)顆粒技術(shù)是UPLC填料的主流技術(shù),通過(guò)鍵合C18基團(tuán)并經(jīng)末端封尾,是UPLC分離中的通用型色譜柱。研究表明,BEH C18相較于傳統(tǒng)C18而言,它們采用三鍵鍵合化學(xué),不僅具有較低的鍵合相流失,且能在pH1～12的范圍內(nèi)使用,同時(shí)保證極性和/或堿性化合物較好的峰形及保留[17]。色譜分離條件見(jiàn)表1,當(dāng)流動(dòng)相分別為乙腈-水(9∶1,v/v)和甲醇-水(9∶1,v/v)時(shí),四種VE異構(gòu)體的分離見(jiàn)圖1。

圖1 BEH C18固定相下不同有機(jī)相分離四種維生素E異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Separation of four vitamin E isomers by differentorganic phases under BEH C18 stationary phase注:A:甲醇-水;B:乙腈-水。

由圖1可知,BEH C18固定相在VE異構(gòu)體保留上和傳統(tǒng)C18固定相相同,β和γ-維生素E不能分離,且柱溫在35 ℃時(shí),作為質(zhì)子供體的甲醇和非質(zhì)子供體的乙腈分別為流動(dòng)相時(shí),目標(biāo)物保留時(shí)間改變分別為0.41、0.60和0.36 min,這說(shuō)明目標(biāo)物在保留過(guò)程中,流動(dòng)相是否為質(zhì)子供體,對(duì)目標(biāo)物的保留影響不大。為了更好地研究BEH C18在不同溫度及流動(dòng)相下的保留特征,本試驗(yàn)以甲醇和乙腈分別作為流動(dòng)相,柱溫變化范圍為30 ℃～50 ℃,以保留時(shí)間(tR)、分離度(Rs)、拖尾因子(Tf)及容量因子(k)為指標(biāo)對(duì)VE異構(gòu)體的保留特征進(jìn)行研究,見(jiàn)表2。

由圖1和表2可知,隨著溫度的升高,無(wú)論使用甲醇或者乙腈,β-VE和γ-VE均不能進(jìn)行有效分離,目標(biāo)物的Tf在1.14～1.46之間,基本滿足色譜對(duì)稱性的要求(0.9

2.2 CSH Fluoro-Phenyl固定相下不同溫度及流動(dòng)相對(duì)異構(gòu)體保留特征的影響

表面帶電雜化顆粒(Charged Surface Hybrid,CSH)技術(shù)下的氟苯基柱(CSH Fluoro-Phenyl)由于氟苯基的存在,帶有低水平的表面電荷,提高樣品負(fù)載量的同時(shí)保持了峰的對(duì)稱性,在分離過(guò)程中具有偶極-偶極作用、芳香性(π-π)作用和疏水作用等多種保留機(jī)理,不僅對(duì)位置異構(gòu)體、鹵代化合物和極性化合物具有優(yōu)異選擇性,且可增強(qiáng)對(duì)酸性化合物的保留[19-20]。色譜分離條件見(jiàn)表1,當(dāng)流動(dòng)相分別為乙腈-水(7∶3,v/v)和甲醇-水(7∶3,v/v)時(shí),四種VE異構(gòu)體的分離見(jiàn)圖2。

表2 不同溫度及流動(dòng)相時(shí)的tR,k,Rs,Tf和NTable 2 tR,k,Rs,Tf and N at different temperature and mobile phase

注:n.a:未響應(yīng);表3、表6同。

圖2 CSH Fluoro-Phenyl固定相下不同有機(jī)相分離四種維生素E異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.2 Separation of four vitamin E isomers by different organic phases under CSH Fluoro-Phenyl stationary phase注:A:甲醇-水;B:乙腈-水。

為了更好的研究CSH Fluoro-Phenyl在不同溫度及流動(dòng)相下的保留特征,本試驗(yàn)同樣以具有質(zhì)子供體的甲醇和非質(zhì)子供體的乙腈作為流動(dòng)相,柱溫變化范圍為30～50 ℃,tR、Rs、Tf及k為指標(biāo)對(duì)VE異構(gòu)體的保留特征進(jìn)行研究,見(jiàn)表3。

表3 不同溫度及流動(dòng)相時(shí)的tR,k,Rs,Tf和NTable 3 tR,k,Rs,Tf and N at different temperature and mobile phase

由圖2和表3可知,CSH Fluoro-Phenyl為固定相時(shí),當(dāng)使用質(zhì)子供體的甲醇和非質(zhì)子供體的乙腈時(shí),由于在分離過(guò)程中存在偶極-偶極作用、芳香性(π-π)作用和疏水作用等作用力,使得四種VE異構(gòu)體的保留特征有著很大的區(qū)別。隨著溫度的升高,使用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí),β和γ-VE能夠達(dá)到部分分離,分離度在0.39～0.55之間,當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí),β-VE和γ-VE重合。此外,目標(biāo)物的Tf在0.68～3.71之間,特別是溫度為50 ℃,甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)γ-VE的Tf達(dá)3.71,這可能是由于固定相上存在多種保留機(jī)理,且較高的溫度增加了目標(biāo)物的二次吸附,導(dǎo)致拖尾[21,23]。再者,當(dāng)使用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí),目標(biāo)物tR是乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)的3.7～6.2倍,且β-VE和γ-VE部分分離。k隨著溫度的升高,使用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí),δ-VE、β-VE和α-VE的平均k值分別是乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)的5.65、6.16和6.57倍,這說(shuō)明甲醇-水為流動(dòng)相時(shí),CSH Fluoro-Phenyl固定相對(duì)目標(biāo)物具有較強(qiáng)的保留能力。由此可以看出,使用CSH Fluoro-Phenyl為固定相時(shí),甲醇-水作為流動(dòng)相,因?yàn)槎喾N保留機(jī)理共同的作用,對(duì)四種VE的保留能力具有較大的影響[21]。

2.3 BEH C18及CSH Fluoro-Phenyl固定相的比較

通過(guò)2.1和2.2節(jié)分別對(duì)VE異構(gòu)體在BEH C18及CSH Fluoro-Phenyl固定相上保留行為的研究可知,BEH C18在乙腈和/或甲醇作為流動(dòng)相時(shí),VE異構(gòu)體的保留行為并未得到較大的改變,β-VE和γ-VE不能進(jìn)行分離,這是因?yàn)殒I合的C18主要具有較強(qiáng)的非極性作用,且固定相、目標(biāo)物以及流動(dòng)相之間的作用力主要為疏水作用力[23]。而使用CSH Fluoro-Phenyl固定相作為色譜柱時(shí),雖然乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí),溫度的改變對(duì)VE異構(gòu)體的保留影響不大,但是甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí),就VE異構(gòu)體的tR而言,目標(biāo)物的tR是乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的3.7～6.2倍,這主要是由于甲醇作為質(zhì)子供體,與鍵合相氟苯基作用力增加,且由于氟苯基的存在,固定相、目標(biāo)物以及流動(dòng)相之間除了疏水作用外,還存在偶極-偶極作用、芳香性(π-π)作用等多種分子間作用力,對(duì)于異構(gòu)體具有較強(qiáng)的分離能力,故β和γ-VE有了部分分離[22]。雖然CSH Fluoro-Phenyl固定相在甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)β-VE和γ-VE有一定的分離能力,但是較高的保留時(shí)間,嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象以及β-VE和γ-VE僅有的部分分離,影響VE的檢測(cè)靈敏度及γ-VE定量的準(zhǔn)確性[24]。鑒于此,本文僅將CSH Fluoro-Phenyl與傳統(tǒng)BEH C18作為不同固定相對(duì)VE保留行為的影響進(jìn)行對(duì)比,后續(xù)研究將以BEH C18作為固定相進(jìn)行方法學(xué)考察及實(shí)際樣品的檢測(cè)研究。

表4 維生素E異構(gòu)體的線性范圍及檢出限Table 4 Linear range and detection limit of vitamin E isomer

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6,%)Table 5 Results of recovery tests

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍和最低檢出限 取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,稀釋成5個(gè)濃度梯度,按優(yōu)化后色譜條件進(jìn)行測(cè)定,并繪制樣品濃度(橫坐標(biāo)x,mg/L)與峰面積(縱坐標(biāo)y,AU)標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸分析,且當(dāng)S/N為3和10時(shí),該方法的最低檢出限(LOD)及定量限(LOQ)如表4所示。結(jié)果表明,使用該方法對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè),在線性范圍內(nèi)具有良好的線性(r>0.9993),均能滿足對(duì)植物油中VE異構(gòu)體檢測(cè)的要求。

2.4.2 樣品加標(biāo)回收率和精密度 在空白樣品中添加高、中、低濃度的VE標(biāo)準(zhǔn)溶液,渦旋2.0 min后靜置10 min,按1.2.2進(jìn)行樣品前處理,按1.2.3所述的色譜條件測(cè)定,以濃度值計(jì)算加標(biāo)回收率。每一添加濃度樣品重復(fù)測(cè)定6次來(lái)計(jì)算其精密度。結(jié)果見(jiàn)表5,結(jié)果顯示,加標(biāo)回收率在82.34%～105.17%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.7%～3.8%之間。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

取所收集的23批次植物油樣品,準(zhǔn)確稱取1.00 g,按1.2.2進(jìn)行樣品處理,按1.2.3所述的色譜條件進(jìn)樣分析,重復(fù)3次,計(jì)算VE的含量,若VE含量超出線性范圍,則使用乙腈對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)的稀釋處理,結(jié)果見(jiàn)表6;部分植物油樣品色譜圖見(jiàn)圖3～圖6。

圖3 大豆油樣品色譜圖Fig.3 Chromatography of soybean oil sample

圖4 橄欖油樣品色譜圖Fig.4 Chromatography of the olive sample

表6 植物油樣品中維生素E的含量Table 6 Contents of vitamin E in oil samples

圖5 菜籽油樣品色譜圖Fig.5 Chromatography of the colleseed oil

圖6 牡丹籽油樣品色譜圖Fig.6 Chromatography of the Peony seed oil sample

由表6可以看出,所分析的23批植物油中,大豆油含有較高的δ-VE和β+γ-VE,含量分別達(dá)109.61和131.19 mg/L,調(diào)和油和菜籽油的VE含量相近,δ-VE、β+γ-VE和α-VE分別為6.01～6.32、69.26～69.99和38.50～43.31 mg/L之間;對(duì)于葵花籽油,牡丹籽油、芝麻油和胡麻油而言,葵花籽油具有較高的α-VE,但牡丹籽油和芝麻油中β+γ-VE卻較高,胡麻油中β+γ-VE和α-VE含量高于δ-VE;作為果肉油的橄欖油,α-VE含量范圍達(dá)103.39～304.54 mg/L,遠(yuǎn)高于β+γ-VE和δ-VE的含量,甚至部分橄欖油中未能檢出δ-VE。由此可推斷果肉油為代表的橄欖油與種子油中VE異構(gòu)體含量有明顯的差別。

3 結(jié)論

本研究利用RP-UPLC作為表征手段,以BEH C18和CSH Fluoro-Phenyl作為兩種不同的固定相,通過(guò)Rs、Tf及k為指標(biāo)對(duì)目標(biāo)物保留特征進(jìn)行評(píng)價(jià),研究目標(biāo)物在不同的色譜柱溫度(30、35、40、45、50 ℃)及不同的有機(jī)相(甲醇和乙腈)下的保留特征。結(jié)果表明,甲醇為有機(jī)相,CSH Fluoro-Phenyl為固定相時(shí),就VE異構(gòu)體的tR而言,目標(biāo)物的tR是乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的3.7～6.2倍,這主要是由于甲醇作為質(zhì)子供體,以及固定相自身具有偶極-偶極作用、芳香性(π-π)作用等多種分子間作用力,對(duì)于異構(gòu)體具有較強(qiáng)的分離能力,故β-VE和γ-VE有了部分分離。其余固定相及色譜條件均未有明顯選擇性差異。此外,利用BEH C18為固定相,乙腈為流動(dòng)相對(duì)不同來(lái)源植物油進(jìn)行了含量測(cè)定,方法學(xué)參數(shù)表明該方法可以滿足植物油中VE的快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)。通過(guò)不同植物油中的VE異構(gòu)體含量的比較,果肉油為代表的橄欖油與種子油中VE異構(gòu)體含量有明顯差別,研究方法可為橄欖油等植物油摻偽鑒別提供依據(jù)及參考。