線葉旋覆花總黃酮的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析

錢慧琴,秦晶晶,魏 婧,王帥帥,李佳祥,張凌云,閆福林

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453000)

線葉旋覆花(Inulalineariifolia)為菊科旋覆花屬多年生草本植物,地上部分入藥,作中藥“金沸草”用,具有散風(fēng)寒、化痰飲、消腫毒、祛風(fēng)濕之效,治療風(fēng)寒咳嗽,伏飲痰喘,脅下脹痛,可瘡腫毒,風(fēng)濕疼痛[1]?，F(xiàn)代藥理作用表明,線葉旋覆花在抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等方面具有顯示較好的生物活性,其主要活性成分為倍半萜、二萜、三萜、黃酮類、生物堿等[2-4]。

黃酮類化合物是一種多羥基酚類的次生代謝產(chǎn)物,普遍存在于自然界中。黃酮類化合物在抗氧化活性、保護(hù)肝臟、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌等方面都具有良好的生物活性,被廣泛應(yīng)用于藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域[5-7]。目前,崔瑩等[8]通過(guò)正交試驗(yàn)得到線葉旋覆花同屬植物旋覆花總黃酮提取工藝的最佳因素水平組合,聶利月[2]、陳莉萍[9]對(duì)線葉旋覆花天然活性成分進(jìn)行研究,而對(duì)于線葉旋覆花總黃酮提取工藝及其抗氧化活性的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

為了研究線葉旋覆花總黃酮最佳的提取工藝,評(píng)價(jià)其抗氧化活性,提高線葉旋覆花的臨床應(yīng)用價(jià)值,本試驗(yàn)以線葉旋覆花地上部位為材料,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法尋找線葉旋覆花總黃酮的最佳提取工藝,并評(píng)價(jià)其對(duì)DPPH·和·OH的清除能力,以期為線葉旋覆花的開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

線葉旋覆花 采集于南陽(yáng)市桐柏縣,經(jīng)藥學(xué)院閆福林教授鑒定為菊科旋覆花屬植物線葉旋覆花的地上部分;蘆丁對(duì)照品 中國(guó)食品藥品檢定研究院;1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·) 東京化成工業(yè)株式會(huì)社;L-抗壞血酸(VC) 上海源葉生物科技有限公司;水楊酸、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

T6型新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度儀 北京普析通用儀器有限公司;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金南儀器廠;HA2004型電子分析天平 上海象平儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 線葉旋覆花預(yù)處理 將采集的線葉旋覆花地上部分洗凈,用濾紙吸干,于60 ℃烘干,粉碎,過(guò)60目篩,將烘干樣品放入廣口瓶中,備用。

1.2.2 線葉旋覆花總黃酮的提取 精密稱定線葉旋覆花莖葉粗粉約1 g,按一定液料比(mL/g)加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,搖勻,于一定溫度下提取一定時(shí)間,之后過(guò)濾,濾液減壓濃縮至浸膏,少量無(wú)水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶,無(wú)水乙醇定容,即得供試品溶液。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 按照“1.2.2”項(xiàng)下線葉旋覆花總黃酮的提取方法,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液料比和提取時(shí)間對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響。

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響 固定提取溫度80 ℃,液料比30∶1 mL/g,提取時(shí)間60 min,提取次數(shù)1次,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%時(shí)對(duì)總黃酮提取量的影響,確定適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.2.3.2 提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,液料比30∶1 mL/g,提取時(shí)間40 min,提取次數(shù)1次,考察提取溫度為50、60、70、80、90 ℃時(shí)對(duì)總黃酮提取量的影響,確定適宜的提取溫度。

1.2.3.3 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,提取時(shí)間40 min,提取溫度80 ℃,提取次數(shù)1次,考察液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g時(shí)對(duì)總黃酮提取量的影響,確定適宜的液料比。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,提取溫度80 ℃,液料比30∶1 mL/g,提取次數(shù)1次,考察提取時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min時(shí)對(duì)總黃酮提取量的影響,確定適宜提取時(shí)間。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液料比、提取時(shí)間為考察因素,以線葉旋覆花總黃酮提取量為響應(yīng)值,采用4因素3水平的試驗(yàn),確定線葉旋覆花總黃酮的最佳提取工藝,試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確量取濃度為100 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.50、1、2、3、4、5 mL,分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中,每個(gè)容量瓶中各加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置6 min,各依次加入0.4 mL 10%硝酸鋁溶液,6 min后再各加入4 mL 4% NaOH溶液,無(wú)水乙醇定容至刻度,搖勻,反應(yīng)15 min后,于510 nm處測(cè)定其吸光度?？瞻讓?duì)照組用相應(yīng)的試劑溶液進(jìn)行上述操作處理。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=0.0113x+0.0184,相關(guān)系數(shù)r=0.9992。此方程具有良好的線性關(guān)系,可用于評(píng)價(jià)線葉旋覆花總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.2.6 線葉旋覆花總黃酮含量測(cè)定 精密吸取線葉旋覆花供試品溶液0.5 mL,置于10 mL容量瓶中,按 “1.2.5” 項(xiàng)下方法測(cè)吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計(jì)算線葉旋覆花總黃酮質(zhì)量濃度,然后總黃酮提取量計(jì)算見(jiàn)式1。

式(1)

其中:Y為線葉旋覆花總黃酮提取量,mg/g;C為線葉旋覆花總黃酮的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為測(cè)量總黃酮提取液體積mL;N為稀釋倍數(shù);m為線葉旋覆花干品質(zhì)量,g。

1.2.7 線葉旋覆花總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 清除 DPPH·能力測(cè)定 參照Cai Hao[10]等的方法并加以修改,將最佳提取工藝條件下提取得到的線葉旋覆花總黃酮溶液配成0.03、0.06、0.08、0.10、0.14、0.20、0.24、0.26 mg/mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,吸取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液置于試管中,依次加入1.3×10-5mol/L的DPPH·乙醇溶液2 mL,搖勻,避光反應(yīng)30 min后,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值A(chǔ)1。同時(shí)測(cè)定2 mL無(wú)水乙醇和2 mL DPPH·乙醇溶液的吸光度值A(chǔ)0,以及2 mL無(wú)水乙醇和2 mL不同質(zhì)量濃度的線葉旋覆花總黃酮溶液的吸光度值A(chǔ)2。對(duì)照組為相同質(zhì)量濃度的VC溶液。DPPH·清除率計(jì)算見(jiàn)式2。

式(2)

式中,A0為2 mL DPPH·乙醇溶液+2 mL無(wú)水乙醇;A1為2 mL DPPH· 乙醇溶液+2 mL樣品溶液;A2為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL樣品溶液。

1.2.7.2 線葉旋覆花總黃酮清除羥基自由基能力測(cè)定 參照許建本等[11]的方法并加以修改,將最佳提取條件下提取得到的線葉旋覆花總黃酮溶液配成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、4.5、5 mg/mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,吸取1 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液置10 mL容量瓶中,依次加入1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,1 mL 9 mmol/L FeSO4,最后加入1.0 mL 8.8 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng),去離子水定容至刻度,于 37 ℃水浴放置30 min后,冷卻,在510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。同時(shí)測(cè)定以1 mL無(wú)水乙醇代替樣品提取液的吸光度值A(chǔ)0,以及1 mL去離子水代替8.8 mmol/L的H2O2,測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。對(duì)照組為相同質(zhì)量濃度的VC溶液。羥自由基清除率計(jì)算見(jiàn)式3。

式(3)

式中,A0為空白吸光度;A1為樣品溶液吸光度;A2為樣品溶液的底吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次,運(yùn)用響應(yīng)面分析軟件Design Expert 8.0.6、SPSS22.0及Excel進(jìn)行相關(guān)圖表的繪制以及數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentrationon flavonoid yield from Inula lineariifolia

由圖1可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～80%之間,線葉旋覆花總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大;乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),總黃酮提取量達(dá)到最大值;乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%,總黃酮提取量呈下降趨勢(shì)。這與井文華等[12]的研究報(bào)道的乙醇對(duì)于總黃酮提取量影響的變化趨勢(shì)一致。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),線葉旋覆花黃酮類物質(zhì)的溶出趨于飽和,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加,提取溶劑的極性相對(duì)降低,促進(jìn)線葉旋覆花中親脂性強(qiáng)的化學(xué)成分的溶出,最終導(dǎo)致線葉旋覆花總黃酮提取量相對(duì)下降。因此,選取80%乙醇體積分?jǐn)?shù)為宜。

2.1.2 提取溫度的影響 提取溫度對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響Fig.2 Effects of extraction temperatureon flavonoid yield from Inula lineariifolia

由圖2可知,提取溫度在40～80 ℃范圍內(nèi),線葉旋覆花總黃酮提取量隨著提取溫度的增加而增大;提取溫度達(dá)到80 ℃時(shí)總黃酮提取量達(dá)到最高;超過(guò)80 ℃時(shí),總黃酮提取量呈下降趨勢(shì)。這與曾橋等[13]研究報(bào)道的溫度對(duì)總黃酮提取量影響的變化趨勢(shì)一致?？赡苁且?yàn)闇囟壬?有利于加快分子運(yùn)動(dòng)的速度,線葉旋覆花中黃酮類化合物的滲透、擴(kuò)散和溶解速度也會(huì)加快,黃酮類物質(zhì)溶出量增加。當(dāng)溫度升高到一定程度,黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞,且其他脂溶性雜質(zhì)的溶出增加,致使總黃酮提取量降低[14]。所以,選取提取溫度80 ℃為宜。

2.1.3 液料比的影響 液料比對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 液料比對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響Fig.3 Effects of liquid-to-solid ratioon flavonoid yield from Inula lineariifolia

由圖3可知,液料比在10∶1～40∶1 mL/g范圍內(nèi),線葉旋覆花總黃酮提取量隨液料比的增加而增大;液料比為40∶1 mL/g時(shí),總黃酮提取量最大;液料比超過(guò)40∶1 mL/g,總黃酮提取量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這與王慧芳等[15]研究料液比對(duì)總黃酮提取量影響的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)殡S著液料比的增加,增加乙醇與線葉旋覆花粗粉的接觸面積,有利于黃酮類物質(zhì)溶出;當(dāng)液料比為40∶1 mL/g時(shí),線葉旋覆花黃酮類化合物的溶出逐漸趨于動(dòng)態(tài)平衡;繼續(xù)增加液料比,非黃酮類可溶性物質(zhì)溶出增多,同時(shí),后續(xù)濃縮提取液的時(shí)間也會(huì)增加。所以,選取液料比 40∶1 mL/g為宜。

2.1.4 提取時(shí)間的影響 提取時(shí)間對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of extraction timeon flavonoid yield from Inula lineariifolia

由圖4可知,提取時(shí)間在10～40 min之間,線葉旋覆花總黃酮提取量隨著提取時(shí)間的增加而增大;當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí),總黃酮提取量達(dá)到最高;超過(guò)40 min后,總黃酮的提取量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這與林香信等[16]研究提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量影響的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)短,黃酮類物質(zhì)不易溶出,使得總黃酮提取量較低。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),線葉旋覆花莖葉與乙醇充分接觸,使線葉旋覆花黃酮類物質(zhì)充分溶出,40 min時(shí),黃酮類物質(zhì)已基本溶出。40 min后,繼續(xù)增加提取時(shí)間,在長(zhǎng)時(shí)間高溫提取的情況下,黃酮類物質(zhì)可能發(fā)生氧化、降解或者是增加其他物質(zhì)的溶出,致使總黃酮提取量下降。因此,選取提取時(shí)間40 min 為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化線葉旋覆花總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時(shí)間(D)4個(gè)因素按照表2設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn),得到線葉旋覆花總黃酮提取量(Y),見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design with experimental values offlavonoid yield for response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,得到以線葉旋覆花總黃酮提取量對(duì)為響應(yīng)值的回歸方程:Y=22.73-9.00A+0.31B-0.68C-1.21D-2.89AB+2.70AC-1.70AD+0.097BC+2.75BD-0.31CD-1.95A2+0.48B2-1.67C2-1.51D2(R2=0.9828),響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

模型中因素一次項(xiàng)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(D),二次項(xiàng)A2、C2、D2對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量有極顯著的影響。交互項(xiàng)中的乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和提取溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和液料比(C)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(D)對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量影響顯著,交互項(xiàng)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)和提取時(shí)間(D)有顯著影響,其余項(xiàng)均不顯著。根據(jù)F值的大小,各個(gè)因素對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響順序依次為:乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>提取時(shí)間(D)>液料比(C)>提取溫度(B)。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化 各因素交互作用對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖5～圖8。圖5～圖8所呈現(xiàn)的響應(yīng)曲面坡度陡峭,說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、提取溫度與提取時(shí)間對(duì)線葉旋覆花總黃酮提取量的影響顯著,這與響應(yīng)面回歸模型分析結(jié)果一致。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度的響應(yīng)曲線Fig.5 RSM analysis for interactive effects ofalcohol concentration and extraction temperature

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的響應(yīng)曲線Fig.6 RSM analysis for interactive effects of alcoholconcentration and solvent-to-solid ratio

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的響應(yīng)曲線Fig.7 RSM analysis for interactive effects ofalcohol concentration and extraction time

圖8 提取溫度與提取時(shí)間的響應(yīng)曲線Fig.8 RSM analysis for interactive effects ofextraction temperature and extraction time

2.2.4 最優(yōu)工藝及驗(yàn)證試驗(yàn) 由Design-Expert 8.0.6軟件得出的最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70.28%,提取溫度87.71 ℃,液料比31.37∶1 (mL/g),提取時(shí)間40.40 min,此條件下線葉旋覆花總黃酮提取量最高,預(yù)測(cè)值為33.982 mg/g。為了驗(yàn)證此條件的有效性,并結(jié)合實(shí)驗(yàn)可操作性,將最佳提取工藝修正為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度87 ℃、液料比31∶1 mL/g、提取時(shí)間40 min,此條件下,重復(fù)3次試驗(yàn),線葉旋覆花總黃酮提取量為(33.62±0.0207) mg/g,與預(yù)測(cè)值基本一致,說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)的線葉旋覆花總黃酮的提取工藝參數(shù)可靠可行。

2.3 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 清除DPPH·的能力 如圖9所示,當(dāng)線葉旋覆花總黃酮質(zhì)量濃度在0.03～0.24 mg/mL范圍內(nèi),對(duì)DPPH·的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加顯著增大;當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)0.24 mg/mL,對(duì)DPPH·清除率趨于平緩。通過(guò)SPSS 22.0軟件數(shù)據(jù)分析,線葉旋覆花總黃酮對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率IC50為0.074 mg/mL,VC對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率IC50為0.082 mg/mL,由此可見(jiàn),線葉旋覆花總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力高于VC,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖9 線葉旋覆花總黃酮和VC的DPPH·清除能力Fig.9 DPPH free radical scavenging capacity offlavonoids from Inula lineariifolia and VC

圖10 線葉旋覆花總黃酮和VC的OH·清除能力Fig.10 hydroxyl radical scavenging capacity offlavonoids from Inula lineariifolia and VC

2.3.2 線葉旋覆花總黃酮清除羥基自由基的能力 如圖10所示,線葉旋覆花總黃酮的質(zhì)量濃度在0.5～4.5 mg/mL范圍內(nèi),對(duì)OH· 的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng),當(dāng)線葉旋覆花總黃酮質(zhì)量濃度超過(guò)4.5 mg/mL,對(duì)OH·的清除逐漸趨于平緩,基本保持在57%以上,其清除能力始終弱于VC,但依然有著明顯的清除羥基自由基的作用。這可能是因?yàn)閂C本身對(duì)羥自由基的清除能力較高,且線葉旋覆花最佳提取溫度過(guò)高,其他雜質(zhì)溶出過(guò)多,后期提取液分離純化不徹底,最終導(dǎo)致黃酮類化合物與其他物質(zhì)之間的相互作用,致使線葉旋覆花總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力弱于VC[17]。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法建立線葉旋覆花總黃酮提取工藝的回歸方程,計(jì)算出最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取溫度為87 ℃、液料比為31∶1 mL/g、提取時(shí)間40 min,此條件下,線葉旋覆花總黃酮提取量為(33.62±0.0207) mg/g,本研究可為線葉旋覆花總黃酮的有效提取提供可靠依據(jù)。體外抗氧化活性研究表明,線葉旋覆花總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯高于VC,但是對(duì)羥基自由基的清除能力明顯弱于VC。線葉旋覆花具有一定的抗氧化活性,可以為線葉旋覆花總黃酮的生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。下一步主要探討線葉旋覆花總黃酮成分的組成,以及黃酮類化合物抗腫瘤方面的生物活性,進(jìn)一步提高線葉旋覆花的附加值,產(chǎn)生更高的經(jīng)濟(jì)效益。