Fengycin對(duì)蘋果青霉病致病菌擴(kuò)展青霉產(chǎn)展青霉素的抑制機(jī)制研究

付瑞敏1,2,張利娟3,張 紅1,陳五嶺

(1.河南財(cái)政金融學(xué)院,河南鄭州 450046;2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710069;3.黃河科技學(xué)院,河南鄭州 450000)

擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)作為蘋果采后病害的主要致病菌,它的感染不僅會(huì)引起果實(shí)嚴(yán)重腐爛,其次級(jí)代謝產(chǎn)物展青霉素(patulin,PAT)還會(huì)危害人體健康,造成極為嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題[1]。因此,既能有效抑制擴(kuò)展青霉又能去除展青霉素的技術(shù)產(chǎn)品的研發(fā)成為當(dāng)前蘋果采后貯藏及加工領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)[2]。本課題組前期采用原位分離及N+注入誘變技術(shù)選育出1株可有效抑制擴(kuò)展青霉的生物拮抗菌B.amyloliquefaciensBA-16-8[3]。通過(guò)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、質(zhì)譜((mass spectrometry,MS)、基因敲除和果實(shí)生防試驗(yàn),分析該拮抗菌代謝產(chǎn)物中的主要抑菌成分,發(fā)現(xiàn)生防菌B.amyloliquefaciensBA-16-8抑制擴(kuò)展青霉的關(guān)鍵物質(zhì)是脂肽類抗生素Fengycin[4]。

Fengycin對(duì)絲狀真菌有很強(qiáng)的抑制作用[5],它不僅可以作用于擴(kuò)展青霉的細(xì)胞膜,使其通透性發(fā)生改變,還可以結(jié)合在擴(kuò)展青霉的核酸上,并抑制其線粒體復(fù)合酶相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而對(duì)擴(kuò)展青霉的呼吸形成抑制并阻礙其蛋白質(zhì)、糖類代謝[6]。

前期研究發(fā)現(xiàn)菌株B.amyloliquefaciensBA-16-8的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液可以使P.expansum分泌的毒素積累量下降,但究竟是抑菌關(guān)鍵物質(zhì)Fengycin降解了展青霉素還是抑制了P.expansum對(duì)展青霉素的合成,具體作用機(jī)制尚未明確[7]。而將BA-16-8的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液直接與展青霉素混合后發(fā)現(xiàn),展青霉素含量并沒(méi)有發(fā)生明顯變化,說(shuō)明BA-16-8對(duì)展青霉素是不具有降解作用的。因此,推測(cè)導(dǎo)致擴(kuò)展青霉發(fā)酵液中毒素積累量下降的原因可能有2點(diǎn):一則是菌株BA-16-8抑制了擴(kuò)展青霉的生長(zhǎng),進(jìn)而導(dǎo)致毒素產(chǎn)量的下降;二則是菌株BA-16-8抑制了擴(kuò)展青霉的產(chǎn)毒能力,即阻礙了擴(kuò)展青霉在合成展青霉素的過(guò)程中某些基因的表達(dá),從而導(dǎo)致了毒素積累量的下降[8-9]。

為驗(yàn)證第一種可能性,探討B(tài).amyloliquefaciens代謝產(chǎn)物Fengycin對(duì)P.expansum表達(dá)展青霉素的影響效果,本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法檢測(cè)單位質(zhì)量P.expansum菌絲體產(chǎn)展青霉素的含量,再用SYBR GreenI Real-time PCR分析合成展青霉素的2個(gè)關(guān)鍵基因6-MSAS和IDH[10-14]在不同濃度Fengycin作用下的表達(dá)水平,以明確Fengycin對(duì)展青霉素的抑制機(jī)制。若第一種可能性成立,則單位質(zhì)量的擴(kuò)展青霉菌絲體中的毒素積累量應(yīng)該不會(huì)隨著Fengycin的處理而發(fā)生變化,旨在為Fengycin的開發(fā)利用及將其用于蘋果采后生物防治提供相應(yīng)的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Fengycin 本實(shí)驗(yàn)室分離純化,純度達(dá)91.28%[6];Trizol 美國(guó)Invitrogen公司;Patulin標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;RNA提取試劑盒 美國(guó)Promega公司;反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(first strand cDNA Synthesis Kit)、SYBR Green熒光染料試劑盒 Takara公司;乙醇、異丙醇等 國(guó)產(chǎn)分析純。

PDA(馬鈴薯平板)改良配方:200 g馬鈴薯(去皮)煮出汁,100 mL脫脂牛乳(0.6%),5 g酵母膏,15 g瓊脂,加水至1000 mL,pH為7.0;PDB(馬鈴薯液體培養(yǎng)基)配方:200 g馬鈴薯(去皮)煮出汁,100 mL脫脂牛乳(0.6%),5 g酵母膏,加水至1000 mL,pH為7.0。

Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR System(美國(guó)ABI公司);Light Cycler 2.0實(shí)時(shí)定量PCR儀 羅氏公司;Aqilent HPLC 1200高效液相色譜分析系統(tǒng)、C18反相柱、ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical Column(5 μm,4.6 nm×250 mm)色譜柱 美國(guó)安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1P.expansum的培養(yǎng)與預(yù)處理 用PDB液體培養(yǎng)基在30 ℃ 180 r/min條件下培養(yǎng)擴(kuò)展青霉(P.expansum)。48 h后,將得到的擴(kuò)展青霉培養(yǎng)液用雙層紗布過(guò)濾,于10000×g離心5 min,收集離心所得沉淀并將其轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中制備擴(kuò)展青霉(P.expansum)菌絲體及孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板將所制備的孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)整至102個(gè)/mL后待用。

1.2.2P.expansum單位質(zhì)量菌絲體產(chǎn)展青霉素的檢測(cè)

1.2.2.1P.expansum菌絲體的液體發(fā)酵培養(yǎng) 在1.2.1制備的102個(gè)/mL的擴(kuò)展青霉孢子懸液中加入一定量Fengycin,使其最終濃度為50 μg/mL,以未加入Fengycin的孢子懸液為對(duì)照。在30 ℃條件下,分別將加入Fengycin的孢子懸液和未加入Fengycin的孢子懸液置于轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床上,振蕩培養(yǎng)7 d。將所得培養(yǎng)液于10000×g離心5 min,取上清液進(jìn)行展青霉素的檢測(cè)。同時(shí)將所得沉淀經(jīng)過(guò)冷凍干燥后進(jìn)行稱質(zhì)量,待用。

1.2.2.2 擴(kuò)展青霉發(fā)酵液中展青霉素的提取 將20 mL乙酸乙酯加入20 mL 1.2.2.1中的上清液中,于180 r/min將其振蕩3 h,使二者充分混勻后進(jìn)行離心處理(3000×g,3 min),取上清液,從上清液中取20 mL,再加入20 mL乙酸乙酯,將其于180 r/min振蕩3 h,使其充分混勻,于3000 g離心3 min后,棄去沉淀,將2次離心所得上清液合并,在40 ℃下用氮?dú)獯滴源蹈梢宜嵋阴?再用1 mL乙酸鹽緩沖液溶解,用0.25 μm濾膜過(guò)濾后,注入HPLC小瓶中,待測(cè)。

展青霉素的檢測(cè)采用C18反相柱,檢測(cè)所用波長(zhǎng)為276 nm,調(diào)整柱溫為35 ℃,流動(dòng)相A[乙腈含0.1%三氟乙酸(TFA)]:流動(dòng)相B(水含0.1%TFA)為1∶9 (v/v),流速為1 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,對(duì)標(biāo)樣和樣品等量進(jìn)樣20 μ L,用外標(biāo)法定量。

1.2.2.3 單位質(zhì)量擴(kuò)展青霉菌絲體中所含展青霉素的檢測(cè) 參照公式(1)進(jìn)行展青霉素含量的測(cè)定。

C=S/Sm×C標(biāo)樣

式(1)

式中:C為待測(cè)樣品展青霉素含量,mg/L;S為待測(cè)樣品展青霉素面積,mm2;Sm為標(biāo)樣展青霉素面積,mm2;C標(biāo)樣為標(biāo)樣展青霉素含量,mg/L。

1.2.3P.expansumRNA的提取及反轉(zhuǎn)錄PCR 取上述離心所得沉淀,用液氮研磨成粉末。用RNA提取試劑盒提取擴(kuò)展青霉的總RNA,整個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。提取結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。如果D260/D280值為1.8～2.0,則表明RNA純度較高,未被DNA污染。反之,則需要進(jìn)行DNA去除試驗(yàn)。將所提取的已經(jīng)通過(guò)RNA純度評(píng)價(jià)的RNA用于反轉(zhuǎn)錄PCR。采用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒合成cDNA第一鏈,,離心后得到cDNA。

采用痕量核酸分析儀檢測(cè)所提樣品在260、280 nm處的吸光度D260、D280,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算D260/D280值,再根據(jù)該比值評(píng)價(jià)所得RNA的純度及是否被DNA污染。

表1 試驗(yàn)所用引物信息Table 1 Primer information

反應(yīng)體系為10 μL:2 μL MgCl2,1 μL 10×RT Buffer,3.75 μL RNase Free dH2O,1 μL dNTP Mixture,0.25 μL RNase Inhibitor,0.5 μL AMV Reverse Transcriptase XL,0.5 μL Oligo dT-Adaptor Primer,1 μL總RNA。反應(yīng)過(guò)程為:30 ℃ 10 min,42 ℃ 20 min,99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min,1個(gè)循環(huán)。

表3 Real-Time PCR反應(yīng)程序Table 3 Real time PCR procedure

1.2.4 SYBR Green I Real-time PCR

1.2.4.1 PCR引物設(shè)計(jì)及合成 在SYBR GreenI Real-time PCR中,為了避免試驗(yàn)過(guò)程中由于RNA的定量、加樣以及PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增速率不均一所導(dǎo)致的誤差,通常需要設(shè)置內(nèi)參。在本試驗(yàn)中,用于SYBR GreenI Real-Time PCR擴(kuò)增的3個(gè)基因分別是P.expansum的展青霉素合成基因6-MSAS、IDH以及內(nèi)參基因18S rDNA。其中,用于擴(kuò)增6-MSAS、IDH的引物是根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)網(wǎng)站上GenBank中P.expansum的展青霉素合成基因6-MSAS和IDH的基因序列,采用軟件Primer Selection 3.0設(shè)計(jì)的。用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的引物采用的是真菌通用引物,引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.4.2 SYBR GreenI Real-time PCR 確定引物后,進(jìn)行Real-time PCR[15]。反應(yīng)模板采用1.2.3中制備的cDNA。

整個(gè)反應(yīng)采用ABI公司的Power SYBR Green Master Mix。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)過(guò)程分別如表2、表3所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR所得產(chǎn)物,并得出溶解曲線。

表2 Real-Time PCR反應(yīng)體系Table 2 Real-time PCR reaction system

1.2.4.3 18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將未經(jīng)Fengycin處理的對(duì)照組擴(kuò)展青霉菌絲體RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行梯度稀釋,對(duì)不同稀釋度的cDNA中的內(nèi)參基因18S rDNA進(jìn)行SYBR Green I Real-time PCR,同時(shí)構(gòu)建相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線縱坐標(biāo)為循環(huán)閾值Threshold(CT),橫坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)RNA相對(duì)濃度的對(duì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Real-time PCR結(jié)束后,通過(guò)ABI7500SDS軟件對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,同時(shí)統(tǒng)計(jì)目標(biāo)基因6-MSAS、IDH以及內(nèi)參記憶18SrDNA的CT值。試驗(yàn)組、對(duì)照組各基因的相對(duì)表達(dá)量均采用公式(2)的2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

ΔΔCT=(CT試驗(yàn)組靶基因-CT試驗(yàn)組內(nèi)參)-(CT對(duì)照組靶基因-CT對(duì)照組內(nèi)參)

式(2)

本試驗(yàn)中涉及的數(shù)據(jù)處理及對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換均采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件,試驗(yàn)結(jié)果的差異性檢測(cè)采用t檢驗(yàn)法。其中,P<0.05表示差異顯著(*),P<0.01表示差異極顯著(**)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fengycin對(duì)P. expansum產(chǎn)毒的影響

為了驗(yàn)證是否是菌株BA-16-8抑制了擴(kuò)展青霉的生長(zhǎng),進(jìn)而導(dǎo)致毒素產(chǎn)量的下降,采用HPLC檢測(cè)了Fengycin處理下單位質(zhì)量擴(kuò)展青霉的菌絲體中展青霉素的積累量,如果第一種可能性成立,則單位質(zhì)量的擴(kuò)展青霉菌絲體中的毒素積累量應(yīng)該不會(huì)隨著Fengycin的處理而發(fā)生變化。

如圖1A,在276 nm波長(zhǎng)處,展青霉素的保留時(shí)間是7.743 min。通過(guò)對(duì)比圖1B和圖1C,發(fā)現(xiàn)經(jīng)50 μg/mL Fengycin處理后的試驗(yàn)組中擴(kuò)展青霉的單位質(zhì)量菌絲所產(chǎn)展青霉素明顯低于對(duì)照組。處理組和對(duì)照組的單位質(zhì)量菌絲體中展青霉素的含量如圖2所示,P.expansum在Fengycin的影響下,實(shí)驗(yàn)組(TR)的PAT明顯低于對(duì)照(CK)。與對(duì)照相比,經(jīng)過(guò)Fengycin處理后,單位質(zhì)量的擴(kuò)展青霉菌絲體中展青霉素的積累量有顯著下降(P<0.05),表明Fengycin在抑制病菌活性的同時(shí),對(duì)其毒素的合成也有抑制功能。

圖1 展青霉素的高效液相色譜結(jié)果Fig.1 HPLC chromatograms of PAT注:A:展青霉素標(biāo)品;B:從對(duì)照P. expansum培養(yǎng)液中提取的展青霉素含量;C:從經(jīng)Fengycin處理的P. expansum培養(yǎng)液中提取的展青霉素含量。

圖2 Fengycin對(duì)P.expansum產(chǎn)展青霉素含量的影響Fig.2 Effect of Fengycin on the production ofPAT produced by Penicillum expansum注:TR:經(jīng)過(guò)Fengycin處理的樣本;CK:對(duì)照樣本。

2.2 Fengycin對(duì)P.expansum 6-MSAS和IDH基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的影響

2.2.1 菌絲體總RNA質(zhì)量檢測(cè) 由圖3可以看出,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組條帶清晰,其中18S RNA、28S RNA條帶尤為清晰,表明總RNA完整度較高且沒(méi)有降解。經(jīng)過(guò)分析對(duì)比D260/D280值,發(fā)現(xiàn)其結(jié)果介于1.8～2.0之間,表明所提取的RNA純度可用于PCR擴(kuò)增[15]。

圖3 P. expansum總RNA的電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of total RNAextracted from Penicillum expansum注:M:marker;T:經(jīng)Fengycin處理的P. expansum;C:對(duì)照;圖4同。

圖4 P.expansum 18S rDNA PCR電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of total 18s rRNAextracted from Penicillum expansum

2.2.2 內(nèi)參基因?qū)DNA模板的檢測(cè) 由圖4可以看出,以處理組、對(duì)照組的cDNA為模板PCR擴(kuò)增出的內(nèi)參基因18S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物具有明亮且單一的條帶,無(wú)明顯的二聚體和非特異性擴(kuò)增條帶,且大小與目的條帶一致(約110 bp),表明所提取的擴(kuò)展青霉的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA質(zhì)量?jī)?yōu)良,無(wú)基因組污染,可作為接下來(lái)Real-time PCR試驗(yàn)中檢測(cè)基因表達(dá)的模板使用。

2.2.3 引物特異性檢測(cè) 對(duì)3個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)設(shè)計(jì)引物的特異性,其熔解曲線見圖5。觀察到6-MSAS、IDH和內(nèi)參基因18S rDNA在圖5中只有1個(gè)單一的峰。這表明本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的PCR引物是具有特異性的,可以用于檢測(cè)基因的表達(dá)情況。

圖5 P. expansum中3個(gè)基因的熔解曲線Fig.5 The melt curves of three gene in Penicillum expansum

2.2.4 內(nèi)參基因18S rDNA熒光PCR擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 對(duì)內(nèi)參基因18S rDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,其濃度分別為1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103、1.2×102、12 IU/mL,選取各濃度內(nèi)參并優(yōu)化反應(yīng)條件后以其為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束可得到相應(yīng)的“S”形熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。該擴(kuò)增曲線見圖6a。以對(duì)應(yīng)RNA的相對(duì)濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、以循環(huán)閾值Threshold(CT)為縱坐標(biāo),得到18S rDNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6b)。由圖6可以看出,內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.996,說(shuō)明條件符合定量要求[12],可以使用法對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。

圖6 內(nèi)參基因18S rDNA熒光PCR擴(kuò)增曲線(a)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)Fig.6 Amplification curve(a)and standard curve(b)of18S rDNA by real-time PCR

2.2.5 Fengycin對(duì)P.expansum目的基因mRNA表達(dá)水平的影響 采用法[15]分析Fengycin對(duì)P.expansum目的基因6-MSAS、IDH的mRNA表達(dá)水平的影響。

通過(guò)內(nèi)參基因18S rDNA進(jìn)行校正,以對(duì)照組中6-MSAS、IDH的mRNA表達(dá)水平為基準(zhǔn),對(duì)加入Fengycin處理后試驗(yàn)組中P.expansum菌絲體的6-MSAS、IDH的mRNA表達(dá)水平的變化情況進(jìn)行定量分析。由表4可以看出,Fengycin的處理可導(dǎo)致擴(kuò)展青霉菌絲體中6-MSAS的表達(dá)水平顯著降低,其表達(dá)水平僅為對(duì)照組的0.11倍,差異極顯著;IDH的表達(dá)水平并未因Fengycin處理而發(fā)生明顯變化,其表達(dá)量為0.93,雖然略微有些降低,但差異不顯著。

Fengycin對(duì)擴(kuò)展青霉合成展青霉素基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用。展青霉素生物合成第一步反應(yīng)是81分子的乙?；o酶A和3分子的丙二?；o酶A合成六甲基水楊酸(6-methylsalicylic acid,6-MSA),該反應(yīng)是由基因6-MSAS所編碼的六甲基水楊酸合酶所催化的,這說(shuō)明展青霉素的合成需要有丙二?；o酶A的參與[16-17],而丙二?；o酶A又同時(shí)是乙?；o酶A合成脂肪酸所必需的,因此丙二?；o酶A無(wú)論在脂肪酸的生物合成、延伸還是在展青霉素等聚酮類物質(zhì)的合成過(guò)程中都起著至關(guān)重要的作用,而Fengycin作為脂肽類抗生素,其化學(xué)機(jī)構(gòu)中是有脂肪酸鏈的[18],因此推測(cè)Fengycin的生物合成與展青霉素的生物合成存在著對(duì)丙二酰基輔酶A的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,Fengycin有可能是通過(guò)該競(jìng)爭(zhēng)性抑制機(jī)制來(lái)降低六甲基水楊酸合酶基因6-MSAS的表達(dá),進(jìn)而降低展青霉素的合成量。該推測(cè)也通過(guò)另一個(gè)基因IDH的表達(dá)情況得以進(jìn)一步證實(shí)。研究中發(fā)現(xiàn),展青霉素合成途徑中另一個(gè)關(guān)鍵基因IDH的表達(dá)情況并未因Fengycin的處理而出現(xiàn)明顯變化。

表4 Fengycin對(duì)P. expansum目標(biāo)基因mRNA表達(dá)水平的影響Table 4 Effects of Fengycin on the mRNA expressionlevel of target genes of Penicillum expansum

3 結(jié)論

結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)Fengycin處理后,單位質(zhì)量的擴(kuò)展青霉菌絲體中展青霉素的積累量有顯著下降,擴(kuò)展青霉展青霉素合成關(guān)鍵基因6-MSAS表達(dá)水平極顯著降低,只有對(duì)照組的11%。而IDH的表達(dá)水平略有下降,但不顯著,為對(duì)照組的93%。由此可知Fengycin可能通過(guò)抑制擴(kuò)展青霉6-MSAS的基因表達(dá)而抑制展青霉素的合成。針對(duì)細(xì)菌的抗菌脂肽Fengycin與P.expansum毒素合成之間關(guān)系的研究,有助于尋找更為有效的途徑抑制真菌及其毒素的產(chǎn)生,對(duì)于蘋果采后青霉病的防治及蘋果副產(chǎn)品中展青霉素的去除具有重要的意義。