響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取雨生紅球藻中蝦青素的工藝

張 曄,劉志偉,譚興和

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室,湖南長沙 410000)

蝦青素(3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素,C40H52O4)是一種脂溶性酮式類胡蘿卜素,具有極強的抗氧化作用,其自由基抗氧化活性比維生素E高500倍,比β-胡蘿卜素高38倍[1]。同時,蝦青素還具有抗癌[2]、增強免疫系統(tǒng)[3]、抵抗組織損傷[4]和心血管疾病等功能[5]。近年來已被廣泛應(yīng)用于化妝品[6]、醫(yī)藥[7]、保健品[8]及水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域[9]。蝦青素主要存在于各種微生物以及微藻中,其中雨生紅球藻是天然蝦青素最主要的來源[10-11]。雨生紅球藻是一種單細(xì)胞雙鞭毛微藻,在逆境條件下(強光、高溫、營養(yǎng)鹽(氮、磷)饑餓、高鹽)經(jīng)過一系列的形態(tài)變化最終形成一種含較高蝦青素含量的成熟紅色、非運動性囊胞[12]。其蝦青素積累量最高可達(dá)藻細(xì)胞干質(zhì)量的4.0%以上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水產(chǎn)品廢棄物(蝦、蟹等甲殼)中和紅發(fā)夫酵母(Phaffiarhodoxyma)(0.15%～0.4%)中蝦青素的含量[13]。但成熟的雨生紅球藻厚而致密的細(xì)胞壁導(dǎo)致有機溶劑很難直接滲透到細(xì)胞內(nèi)部,影響胞內(nèi)蝦青素提取效率[14],因此雨生紅球藻破壁處理成為蝦青素提取的關(guān)鍵工藝。

目前常用的蝦青素提取方法主要有超聲波輔助和微波輔助提取[15]、有機溶劑浸提[16]、酶法輔助提取[17]、超臨界流體萃取法[18]以及高壓均質(zhì)法[19]。超聲波和微波輔助提取設(shè)備昂貴、并且Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)采用超聲波輔助和微波輔助提取會降低蝦青素的生物活性。直接使用有機溶劑浸提不僅耗費時長,且提取率較低,Sarada等[21]使用了多種有機溶劑進行浸泡提取,其中最好的一種有機溶劑提取率也只有22%。超臨界流體CO2萃取法成本較高,不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。高壓均質(zhì)法對均質(zhì)機設(shè)備要求較高,且在生產(chǎn)中設(shè)備零件損耗較大,常常不能連續(xù)生產(chǎn)。相較于其他幾種方法,酶法具有反應(yīng)條件溫和、設(shè)備操作簡單、用料少、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點,被認(rèn)為是最具潛力的一種提取方法。Kobayashi等[22]使用了纖維素酶和裂解酶處理雨生紅球藻,有效地獲得了蝦青素但并沒有具體探討工藝參數(shù)對蝦青素提取率的影響。

雨生紅球藻細(xì)胞壁是由纖維素蛋白和果膠物質(zhì)組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),采用纖維素酶和果膠酶能夠水解植物細(xì)胞壁,提高生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性,加速細(xì)胞內(nèi)溶物質(zhì)流出功能[23-24]。溶菌酶同樣能夠有效地降解細(xì)胞壁的成分,有助于細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的釋放[25-26]。因此,本文采用了纖維素酶、果膠酶和溶菌酶三種單酶以及四種不同比例的復(fù)合酶輔助破壁提取雨生紅球藻蝦青素。通過響應(yīng)面法對酶法提取條件進行了優(yōu)化,旨在為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的參考條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻粉 云南省白鷗生物技術(shù)有限公司,純度:3.5%;纖維素酶(酶活力:400 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;果膠酶(酶活力:500 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;溶菌酶(酶活力:20000 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;乙酸、乙酸鈉、甲醇均(分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

H-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理化學(xué)光學(xué)儀器廠;TGW16臺式高速微量離心機 長沙英泰儀器有限公司;WFJ-7200型可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;AL-204電子天平(精確至0.0001 g) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;PHS-3C pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預(yù)處理 雨生紅球藻粉末冷凍干燥后用鋁箔紙密封儲存于-18 ℃中備用。

1.2.2 酶法提取雨生紅球藻中蝦青素工藝 參考Liu等[27]的方法,固定料液比為10∶1 (mg/mL)準(zhǔn)確稱取10 mg雨生紅球藻粉末置于10 mL連蓋離心管中,加入1 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,調(diào)節(jié)pH,分別加入一定量的纖維素酶、果膠酶、溶菌酶以及復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶=1∶1 (U/U);纖維素酶∶果膠酶=2∶1 (U/U);纖維素酶∶果膠酶=1∶2 (U/U)纖維素酶∶果膠酶∶溶菌酶=1∶1∶1 (U/U/U)),在預(yù)定條件下進行酶解反應(yīng),滅酶后用9000 r/min的離心機離心10 min,取離心沉淀物加入4 mL甲醇在50 ℃水浴鍋中提取1 h,收集上清液再加4 mL甲醇于50 ℃水浴鍋中提取1 h,合并兩次上清液,備用。

1.2.3 酶法提取雨生紅球藻中蝦青素單因素實驗

1.2.3.1 酶的種類和酶含量大小對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 酶法提取過程中,影響提取率最重要的因素是酶的種類和酶含量大小。為了探究這些因素對蝦青素提取率的影響規(guī)律,對反應(yīng)條件進行了設(shè)置:在大量預(yù)實驗的基礎(chǔ)上控制酶解溫度為50 ℃,酶解pH為5.0,酶解時間為6 h,比較單一酶(纖維素酶、果膠酶、溶菌酶)、復(fù)合酶(纖維素∶果膠酶=1∶1,U/U;纖維素∶果膠酶=2∶1,U/U;纖維素酶∶果膠酶=1∶2,U/U;纖維素酶∶果膠酶∶溶菌酶=1∶1∶1,U/U)在加酶量為5000、6000、7000、8000、9000、10000 U/mL時對雨生紅球藻中蝦青素提取率的影響,每個處理組設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3.2 酶解時間對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 選取提取率最高的一組酶,固定酶解溫度50 ℃、pH5.0,加酶量為7000 U/mL,分別測定酶解時間為4、5、6、7、8 h對雨生紅球藻蝦青素的提取率的影響。每個處理組設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3.3 酶解溫度對雨生紅球藻蝦青素的影響 選取提取率最高的一組酶,固定酶解pH5.0、酶解時間6 h,加酶量為7000 U/mL,分別測定了酶解溫度30、40、50、60、70 ℃對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響。每個處理組設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3.4 酶解pH對雨生紅球藻蝦青素的影響 選取提取率最高的一組酶,固定酶解時間6 h、酶解溫度50 ℃,加酶量為7000 U/mL,分別測定了酶解pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響。每個處理組設(shè)3個重復(fù)。

1.健全完善巡視工作制度體系。認(rèn)真梳理已經(jīng)建立的規(guī)章制度，學(xué)習(xí)借鑒上級出臺的制度規(guī)范，針對企業(yè)巡視工作的現(xiàn)實和長遠(yuǎn)需要，制定完善配套制度，形成與企業(yè)巡視工作發(fā)展相適應(yīng)的系統(tǒng)規(guī)范、配套完善的制度體系。研究制定巡視工作領(lǐng)導(dǎo)小組、辦公室和巡視組工作規(guī)范，巡視工作有關(guān)事項移交督辦辦法，巡視發(fā)現(xiàn)重大問題線索的處理辦法，巡視工作成果運用協(xié)調(diào)機制等規(guī)章制度，使巡視工作的制度體系在巡視實踐中得到不斷豐富和完善。

1.2.4 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上,選擇纖維素與果膠酶酶活力配比為(1∶1,U/U),加酶量為7000 U/mL,以酶解溫度、酶解時間和pH作自變量,進行響應(yīng)面試驗,以蝦青素提取率為指標(biāo),確定復(fù)合酶提取雨生紅球藻蝦青素的最佳工藝參數(shù)。試驗因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of theoptimization paramters used in response surface analysis

1.3 蝦青素含量的測定。

采用美國Cyanotech公司[28]的方法測定蝦青素的含量。得到的上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)于476 nm處測定吸光值,甲醇用于空白測定。提取率表示提取得到的蝦青素占雨生紅球藻中蝦青素總量的比例。按下列公式進行計算。

X(mg)=C×8×15

式中：C:類胡蘿卜素的含量;A:476 nm處的吸光值;250:消光系數(shù)。

X:類胡蘿卜素的質(zhì)量;8:甲醇的體積;15:稀釋倍數(shù)。

Y:雨生紅球藻中蝦青素的提取率;M:樣品的質(zhì)量(mg);80%:類胡蘿卜素中蝦青素的含量;3.5%:藻粉中蝦青素的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.5、Design-Expert 8.0和SPSS 18.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 酶的種類和加酶量對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 結(jié)果如圖1所示,不同種類的酶對雨生紅球藻蝦青素的提取率均隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)先增大后緩慢下降的變化趨勢。造成這種現(xiàn)象的原因主要是因為酶解底物有限,當(dāng)酶解反應(yīng)達(dá)到飽和時,繼續(xù)增大加酶量會引起酶的競爭性抑制作用,導(dǎo)致提取率的降低[29]。

圖1 酶種類和酶活力大小對雨生紅球藻中蝦青素提取率的影響Fig.1 Effects of type and activity of enzymeon the yield of astaxanthin from H. pluvialis注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 酶解時間對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 如圖2所示,當(dāng)酶解時間小于6 h時,蝦青素提取率間具有顯著差異(P<0.05),蝦青素的提取率隨著酶解時間的增加而增大,由53.64%升高到了70.19%;并且在6 h時,蝦青素的提取率達(dá)到最大,為70.19%,酶解反應(yīng)在4～6 h內(nèi),復(fù)合酶的活性逐漸達(dá)到最大,能夠充分地與紅球藻細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)反應(yīng),增強了酶的滲透效果,促進了細(xì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的流出。繼續(xù)延長酶解時間提取率反而有所下降,由70.19%下降到66.85%。出現(xiàn)這種變化趨勢的原因主要是因為在一定時間范圍內(nèi),隨著酶解時間的延長,酶解反應(yīng)逐漸反應(yīng)徹底,超出一定時間范圍后,繼續(xù)延長反應(yīng)時間反而會抑制酶活性的發(fā)揮。此外,從雨生紅球藻中釋放出的蝦青素不穩(wěn)定,長時間暴露于外部環(huán)境中可能發(fā)生氧化降解反應(yīng),因此延長提取時間內(nèi)觀察到蝦青素提取率降低可能反應(yīng)了由于氧化導(dǎo)致蝦青素的損失[31-32],所以選擇最佳酶解時間為6 h。

圖2 酶解時間對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on theyield of astaxanthin from H.pluvialis

2.1.3 酶解溫度對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 如圖3所示,不同的酶解溫度對蝦青素的提取率均具有顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)溫度低于50 ℃時,隨著溫度的升高,蝦青素的提取率也隨之升高,從48.76%升高到了70.08%,并且在50 ℃提取率達(dá)到最大;當(dāng)溫度超過50 ℃時,蝦青素提取率急劇下降,從70.08%下降到了40.70%。造成該趨勢的主要原因是因為在一定溫度范圍內(nèi),酶的活性會隨著溫度的升高逐漸升高,當(dāng)達(dá)到酶的最大活性時,繼續(xù)升高溫度酶受熱發(fā)生變性,導(dǎo)致酶活力的降低甚至失活,從而減緩的蝦青素的提取率。這一結(jié)果與Zuorro等[33]使用酶法提取微藻中油脂的報道一致。并且溫度過高對蝦青素的結(jié)構(gòu)也會造成一定的破壞。因此選擇最佳酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響Fig.3 Eeffect of hydrolysis temperatureon the yield of astaxanthin from H.pluvialis

2.1.4 酶解pH對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 如圖4所示,當(dāng)pH低于5.0時,蝦青素提取率隨著pH的升高逐漸升高且具有顯著性差異(P<0.05),由48.41%升高到了70.11%,并且在pH為5.0時達(dá)到最大;當(dāng)pH超過5.0時,蝦青素的提取率顯著下降(P<0.05),由70.11%下降到了48.96%。說明pH過大過小都會對酶解反應(yīng)造成較大的影響,只有在最適的pH范圍內(nèi),酶與底物才會充分結(jié)合,酶解反應(yīng)速度達(dá)到最大。因此,當(dāng)纖維素-果膠酶復(fù)合酶的pH在5.0左右時,其酶活性最好,對雨生紅球藻細(xì)胞壁的降解和破壞達(dá)到最大。李亞輝等[34]使用纖維素酶和果膠酶復(fù)合提取蘆薈多糖也是在酸性范圍內(nèi)獲得最佳pH。所以選擇最佳酶解pH為5.0。

圖4 pH對雨生紅球藻蝦青素提取率的影響Fig.4 Effect of pH values on theyield of astaxanthin from H. pluvialis

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果 響應(yīng)面設(shè)計:固定加酶量為7000 U/mL,復(fù)合酶中纖維素酶和果膠酶酶活力配比為1∶1 (U∶U),以酶解時間(A)、酶解溫度(B)和酶解pH(C)為自變量,以雨生紅球藻蝦青素提取率為響應(yīng)值,結(jié)果見表2。用Design-Expert 8.0軟件對表三數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到雨生紅球藻蝦青素提取率對上述3個自變量的二次回歸方程:Y=69.95-1.44A-3.32B-1.15C-4.34AB+2.22AC-3.00BC-4.58A2-15.12B2-6.67C2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and correspondingresults for response surface analysis

2.2.2 回歸模型方差分析 對回歸模型及其系數(shù)進行顯著性檢驗(表3),結(jié)果表明該試驗選用的模型極顯著(P<0.0001),方差失擬項不顯著(P=0.3820>0.05),說明模型的選擇是合理的;此外,回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.9883,表明二次回歸方程與試驗結(jié)果的擬合度良好,可以用于復(fù)合酶提取雨生紅球藻蝦青素的分析與預(yù)測。同時,從表3結(jié)果還可以得出酶解溫度(B)、酶解pH和酶解溫度交互項(AB)、酶解溫度和酶解時間交互項(BC)、酶解pH二次項(A2)、酶解溫度二次項(B2)、酶解時間二次項(C2)極顯著(P<0.01),酶解pH(A)、酶解pH和酶解時間交互項(AC)均顯著(P<0.05),說明這幾個因素對蝦青素提取率影響較大,根據(jù)F值大小,可知影響因素的主次順序為:A(酶解溫度)>B(酶解pH)>C(酶解時間)。

表3 二次多項式回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance the regression model

2.2.3 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件的確定 為了進一步分析酶解時間、酶解溫度和酶解pH對響應(yīng)面值的影響,固定其中的1個因素,使其處于中心水平,繪制其他兩個因素交互作用的響應(yīng)面,對兩因素的相互作用進行分析。圖5所示的3組響應(yīng)面及等高線的形狀可以分析出隨著各因素水平的升高或延長,蝦青素的提取率均呈現(xiàn)先增大后減少的變化特征。并且,響應(yīng)面的陡峭程度和等高線的形狀可以反應(yīng)兩因素之間的作用顯著程度。其中,響應(yīng)面越陡,等高線的形狀越偏向橢圓表明兩因素之間的交互作用越顯著。由圖c可以清楚的看出酶解溫度和酶解pH之間的交互作用最顯著,且等高線沿酶解溫度軸變化更加密集,而沿pH軸變化相對稀疏,最后結(jié)合響應(yīng)面的陡峭程度得出酶解溫度對蝦青素提取率的影響要大于酶解pH。同理,由圖a、b可以得出酶解時間對蝦青素提取率的影響要低于酶解溫度和酶解pH,這與表3方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對雨生紅球藻蝦青素提取率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showingthe effects of interactions among different factorson the extraction yield of astaxanthin from H.pluvialis

2.2.4 提取工藝的優(yōu)化與驗證 通過Design-Expert 8.0分析優(yōu)化,得出酶法提取雨生紅球藻中的蝦青素的最佳工藝條件為酶解時間5.91 h、酶解pH4.93、酶解溫度49.19 ℃,在此條件下,蝦青素的提取率預(yù)測值為70.21%。

為了驗證響應(yīng)面優(yōu)化的可行性,采取優(yōu)化后的條件進行酶法提取雨生紅球藻中蝦青素的驗證實驗。考慮到操作的可行性,將酶解時間設(shè)為6 h、酶解pH4.9,酶解溫度為49 ℃,在此條件下進行了5次重復(fù)試驗。經(jīng)上述優(yōu)化后的條件提取后,雨生紅球藻中蝦青素的平均提取率為71.08%,與預(yù)測值相比,相對誤差為1.2%,因此響應(yīng)面優(yōu)化后的條件是可行的,具有實用價值。

3 結(jié)論

本實驗在單因素的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對復(fù)合酶提取雨生紅球藻蝦青素的條件進行了優(yōu)化,并建立了可靠的二次多項模型。通過方差分析表明,模型的擬合度較好。在纖維素酶和果膠酶酶活力配比1∶1 (U/U),加酶量7000 U/mL條件下,優(yōu)化最優(yōu)組合為:酶解時間6 h、酶解pH4.9、酶解溫度為49 ℃。在此條件下重復(fù)5次實驗得到的平均提取率為71.08%±0.26%,與預(yù)測值相對誤差為1.2%,具有良好的擬合度。其中采用混合有機溶劑直接浸提法[35]和變頻微波輔助提取法[36],得到的蝦青素提取率分別為36.21%和36.88%,相比之下采用復(fù)合酶法能夠使蝦青素的提取率得到大幅度的提升?？蔀楣I(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的參考價值。