C57 BL/6 小鼠腸道線蟲的分離與鑒定

孔垂民,張 燦,李軍偉,劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)于生命科學(xué)研究和生物技術(shù)的發(fā)展發(fā)揮著不可替代的作用,其健康程度關(guān)系到試驗(yàn)成果的科學(xué)性。實(shí)驗(yàn)小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的重要組成部分,寄生蟲感染一直是影響實(shí)驗(yàn)小鼠健康及實(shí)驗(yàn)效果的主要病原體之一。并且某些寄生蟲疾病屬于人獸共患病,嚴(yán)重威脅研究人員及養(yǎng)殖人員的身體健康,所以對(duì)小鼠腸道寄生蟲病進(jìn)行及時(shí)診斷意義重大。

四翼無(wú)刺線蟲(Aspiculuris tetraptera)和隱匿管狀線蟲(Syphacia obvelata)同屬尖尾目、尖尾科、土源性寄生蟲,是小鼠常見(jiàn)的腸道寄生蟲,同為人獸共患寄生蟲[1]。兩種線蟲生活史均為直接發(fā)育型,多宿主寄生蟲,在實(shí)驗(yàn)小鼠的腸道中常見(jiàn),多混合感染。也有關(guān)于人感染此兩種線蟲的報(bào)道[2]。小鼠嚴(yán)重感染兩種線蟲時(shí),會(huì)導(dǎo)致腸道功能紊亂,影響增重,生理生化指標(biāo)發(fā)生改變,影響動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果。

2017 年10 月,某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)送檢20 只C57BL/6 小鼠,小鼠被毛粗亂無(wú)光澤、消瘦、食欲減退、聚堆,反應(yīng)遲鈍。經(jīng)詢問(wèn)養(yǎng)殖人員了解到,發(fā)病場(chǎng)房養(yǎng)殖密度100 只/m2,小鼠大范圍出現(xiàn)上述臨床癥狀,嚴(yán)重生長(zhǎng)發(fā)育不良,體重不達(dá)標(biāo),但小鼠無(wú)大范圍死亡現(xiàn)象。經(jīng)抗生素治療,無(wú)明顯效果。送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),懷疑寄生蟲感染,對(duì)糞便進(jìn)行檢查,剖檢小鼠,通過(guò)顯微鏡對(duì)發(fā)現(xiàn)的蟲卵及蟲體進(jìn)行了初步的形態(tài)學(xué)鑒定,然后提取DNA,進(jìn)行18S rDNA 基因片段的擴(kuò)增和序列分析,診斷結(jié)果表明,送檢的小鼠均感染S.obvelata和A.tetraptera,具體過(guò)程報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源及主要試劑 某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的C57BL/6 小鼠20 只。DNA 裂解液及PCR 試劑購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.2 蟲卵觀察 收集C57BL/6 小鼠的新鮮糞便,飽和鹽水漂浮法分離糞便中的蟲卵,顯微鏡下觀察蟲卵形態(tài)。

1.3 小鼠腸道病變觀察及蟲體鏡檢 對(duì)小鼠禁食24 h 后,脫頸處死,消毒后剖檢,觀察各臟器病變,分別對(duì)小鼠的十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸進(jìn)行分段剖檢,將剖檢后的腸道及其內(nèi)容物一同放入盛有生理鹽水的玻璃平皿中,用異物針挑取蟲體,顯微鏡下觀察蟲體形態(tài)。

1.4 18S rDNA 基因的擴(kuò)增及序列分析

1.4.1 蟲體基因組DNA 的提取 根據(jù)寄生蟲鏡檢情況,挑取外部形態(tài)相同的10～15 條蟲體到PBS中,吹打洗滌3 次后,置于1.5 mL 離心管中,加入100 μL DNA 裂解液,按照DNAiso Reagent 說(shuō)明書分別提取2 種線蟲的基因組DNA,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 18S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析以提取的2 種線蟲的DNA 為模板,Vandergast 等[3]使用的18S-5F/18S-9R 為引物,分別對(duì)兩種線蟲的18S rDNA 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,與預(yù)期片段大小一致的PCR產(chǎn)物送往上海派森諾生物股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI 網(wǎng)站核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 比對(duì),比對(duì)結(jié)果用MEGA7 進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 糞便中蟲卵的分離與鑒定 應(yīng)用飽和鹽水漂浮法檢查C57BL/6 小鼠糞便,小鼠糞便中發(fā)現(xiàn)了兩種形態(tài)的蟲卵。其一,蟲卵大小(116～130)μm×(28～38)μm,卵殼薄,兩側(cè)不對(duì)稱,一側(cè)較平直,一側(cè)圓凸,似半月?tīng)?圖1A)。其二,蟲卵大小(87.5～90)μm×(34.5～41)μm,橢圓形,卵殼薄(圖1B)。根據(jù)蟲卵的形態(tài),可確定小鼠至少感染兩種寄生蟲。

圖1 兩種蟲卵的鏡檢形態(tài)

2.2 C57BL/6 小鼠腸道剖檢觀察 C57BL/6 小鼠剖解后,在盲腸和結(jié)腸發(fā)現(xiàn)感染程度不同的寄生蟲,蟲體數(shù)量因個(gè)體而異,嚴(yán)重者腸道中充滿寄生蟲,可見(jiàn)腸道出血,其他臟器未見(jiàn)明顯病變。

2.3 疑似隱匿管狀線蟲形態(tài)學(xué)觀察 小鼠盲腸發(fā)現(xiàn)的蟲體均呈白色,線狀,雌蟲長(zhǎng)3～5 mm(圖2A)。成熟的雌蟲,子宮內(nèi)充滿蟲卵,口孔有唇瓣環(huán)繞,頭泡發(fā)達(dá)程度存在個(gè)體差異,有一圓柱狀食道,食道后連有發(fā)達(dá)的圓形食管球,陰門位于蟲體的前1/6～1/5處(圖2B)。未成熟雌蟲觀察,可清晰地看到子宮呈八字懸浮在腹腔后部(圖2C)。雄蟲蟲體1～1.4 mm,泄殖孔后蟲體急劇變細(xì),尾尖細(xì)長(zhǎng)。上述蟲體與蟲卵特征,初步判定為隱匿管狀線蟲。

圖2 隱匿管狀線蟲的鏡檢形態(tài)

2.4 疑似四翼無(wú)刺線蟲的形態(tài)學(xué)觀察 在小鼠結(jié)腸發(fā)現(xiàn)的蟲體均呈白色,線狀,雌蟲長(zhǎng)2.5～4 mm(圖3A)?？诳字車? 片唇瓣環(huán)繞,有半橢圓形頭泡,發(fā)達(dá)的寬頸翼,頸翼的起始位置為頭泡中部,終止位置存在個(gè)體差異,多終止于食管球中部。有一棒狀食道,食管球呈扁橢圓形(圖3B)。陰門位于蟲體的前1/3～1/2 處,可見(jiàn)U 形陰道(圖3C)。成熟蟲體,子宮中從陰門到腸道末段都充滿蟲卵,尾部呈圓錐形。雄蟲體長(zhǎng)略小于雌蟲,頭部與雌蟲相似,尾部向腹部彎曲,可見(jiàn)寬尾翼,尾根呈圓錐形,無(wú)交合刺(圖3D)。根據(jù)蟲卵及蟲體形態(tài),可初步判斷為四翼無(wú)刺線蟲。

2.5 兩種線蟲的18S rDNA 基因片段的PCR 擴(kuò)增結(jié)果 以通用引物對(duì)提取的兩種寄生蟲基因進(jìn)行18S rDNA 基因的擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知,條帶大小為850 bp 左右,與預(yù)期目的條帶大小一致。

圖3 四翼無(wú)刺線蟲的鏡檢形態(tài)

圖4 18S rDNA 基因PCR 擴(kuò)增

2.6 18S rDNA 的測(cè)序比對(duì)分析 測(cè)序獲得的2種18S rDNA 序列提交到NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中,進(jìn)行Blast 比對(duì),結(jié)果表明擴(kuò)增得到的基因序列分別與隱匿管狀線蟲和四翼無(wú)刺線蟲的同源性達(dá)99%。

2.7 兩種寄生蟲的18S rDNA 遺傳進(jìn)化分析下載與兩種線蟲同源性較高的基因序列,使用MEGA7 軟件制作遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖5)。結(jié)果表明,分離的四翼無(wú)刺線蟲與GenBank 登錄號(hào)EF464551.1 的四翼無(wú)刺線蟲同源性最高,隱匿管狀線蟲與GenBank 登錄號(hào)EF464554.1 的隱匿管狀線蟲同源性最高。

圖5 隱匿管狀線蟲和四翼無(wú)刺線蟲的18S rDNA 序列進(jìn)化樹(shù)

3 討論

線蟲蟲體、蟲卵的大小、頭部結(jié)構(gòu)、食管球、尾部的形態(tài)特征以及外生殖器官的位置,經(jīng)常被作為線蟲的分類依據(jù)[4]。但寄生蟲種類繁多,同一種線蟲的發(fā)育狀況存在著個(gè)體差異,部分蟲卵的形態(tài)大小比較相近,所以有時(shí)僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定難以做出準(zhǔn)確判斷。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展,DNA 探針技術(shù)、PCR 技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于寄生蟲診斷中,不但提高了檢測(cè)效率,而且可從基因水平上對(duì)寄生蟲進(jìn)行種屬親緣性鑒定和進(jìn)化分析。18S rDNA 作為真核生物基因組的保守基因,已經(jīng)廣泛用于寄生蟲的分類鑒定,是寄生蟲學(xué)形態(tài)鑒定的重要補(bǔ)充。徐芬[5]利用18S rDNA 基因序列對(duì)索科線蟲進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。Sharmal 等[6]利用18S rDNA 的ITS 序列,對(duì)膜殼屬的絳蟲進(jìn)行了鑒定。本試驗(yàn)利用18S rDNA 基因序列成功對(duì)兩種線蟲做出診斷。但Leblance 等[7]利用18S rDNA 的通用引物對(duì)蟯蟲進(jìn)行檢測(cè)時(shí),由于環(huán)境污染導(dǎo)致出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果。所以只有分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察兩種方法相互結(jié)合驗(yàn)證,才能確保診斷的準(zhǔn)確率。

本試驗(yàn)對(duì)患病小鼠的腸道進(jìn)行了分段剖檢,僅在盲腸段檢出隱匿管狀線蟲,在結(jié)腸段檢出四翼無(wú)刺線蟲,說(shuō)明此類寄生蟲的寄生部位具有專一性,與之前報(bào)道一致。對(duì)分離到的兩種線蟲進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)與本試驗(yàn)分離到的兩種線蟲同源性最高的隱匿管狀線蟲和四翼無(wú)刺線蟲是在2007 年美國(guó)的小鼠中分離出的,說(shuō)明兩種線蟲分布廣泛,無(wú)地域分布特征。

兩種線蟲同為土源性寄生蟲,發(fā)育周期短,感染20 d 左右,宿主糞便中可見(jiàn)蟲卵。蟲卵可在外界直接發(fā)育成感染期病原體,病原傳播不需要中間宿主,一旦有小鼠感染,會(huì)迅速在群體中傳播。此類寄生蟲一旦感染,很難杜絕重復(fù)感染,所以對(duì)于寄生蟲病的預(yù)防,一定要保持飼養(yǎng)室內(nèi)外整潔無(wú)灰塵,嚴(yán)防飲水、飲食及墊料的污染及野鼠的出沒(méi)?；\具、食具和出入廠區(qū)的人員要及時(shí)消毒,堅(jiān)持每月小消毒,每季大消毒,規(guī)范養(yǎng)殖方式。鑒于該場(chǎng)房的感染情況,建議養(yǎng)殖場(chǎng)淘汰小鼠,更換墊料和飼料,降低飼養(yǎng)密度,對(duì)場(chǎng)區(qū)進(jìn)行全面消毒后重新引種。