羔羊致病性沙門菌分離鑒定與藥敏試驗

王恒月

(湖北省興山縣高橋鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)中心,湖北 興山 443715)

2018 年3 月,南京地區(qū)某養(yǎng)羊場,35 日齡的羔羊出現(xiàn)精神沉郁、厭食、排出黏性帶血惡臭的糞便、腹瀉2～3 d 后出現(xiàn)死亡。為了研究引起羔羊死亡的病原菌,無菌采集病死羔羊的肝臟、腸內(nèi)容物等病料組織分離出1 株沙門菌,因此對分離沙門菌進行致病性、耐藥性研究。為沙門菌引起羔羊腹瀉的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2018 年3 月,南京地區(qū)某養(yǎng)羊場無菌采集病死羔羊的肝臟、腸內(nèi)容物等病料組織。

1.2 主要試劑 S.S.培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、革蘭染色試劑盒,購自北京華越洋生物技術(shù)有限公司;腸桿菌科生化鑒定條、藥敏紙片,均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司;DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix,均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;7%綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)基由本實驗室自制,常規(guī)的試劑及儀器由本實驗室提供。

1.3 實驗動物 25±2 g 體重昆明系小鼠10 只,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心提供。

1.4 細菌分離與培養(yǎng) 將采集的病死羔羊的肝臟、腸內(nèi)容物等病料組織接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h,選取單個優(yōu)勢菌接種于S.S.瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h 后,挑取單個菌落接種營養(yǎng)肉湯中進行純化培養(yǎng),取純化培養(yǎng)分離菌株革蘭染色鏡檢觀察細菌形態(tài)學(xué)。

1.5 細菌的生化鑒定 按照說明書將純化的分離菌株接種于腸桿菌科生化鑒定條中,37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h 后,用ATB 自動生化鑒定系統(tǒng)對分離菌株進行細菌的生化特性鑒定。

1.6 細菌的16S rRNA PCR 擴增與測序 用水煮法提取分離菌株的DNA 基因組,設(shè)計細菌16S rRNA 通用引物27F 5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′,1492R 5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。對分離菌株用降落PCR擴增與鑒定。PCR 反應(yīng)體系與條件,2×TaqMix 12.5 μL,Primer Mix(10 μmol/L)各1 μL,DNA 模板各2 μL,ddH2O 補至25 μL;95 ℃5 min;95 ℃30 s,58 ℃30 s,72 ℃30 s,循環(huán)35 次;72 ℃10 min。將分菌株的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測序結(jié)果與GenBank 中登錄參考基因序列進行同源性分析。

1.7 細菌致病性試驗 將10 只昆明系小鼠隨機分為2 組,試驗組每只小鼠通過灌胃的方式攻毒0.25 mL(108CFU/mL),對照組給予等量的無菌生理鹽水。在攻毒12 h 后,觀察6 d,并記錄試驗組小鼠的發(fā)病與死亡,對于死亡的小鼠進行細菌學(xué)分離鑒定。

1.8 藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B 紙片法進行試驗操作和結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)結(jié)果 在血液瓊脂培養(yǎng)基上長出了白色、光滑濕潤、邊緣整齊的大小一致的菌落;在S.S.瓊脂培養(yǎng)基上長出了光滑、圓形、灰白色中間帶有黑心的菌落;普通培養(yǎng)基上長出濕潤的小菌落。革蘭染色鏡檢可見分離菌株呈散在的革蘭陰性短桿菌,無莢膜和芽孢。

2.2 細菌生化試驗結(jié)果 分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;不發(fā)酵蔗糖、尿素、酵乳糖;V-P 試驗、吲哚試驗呈陰性,產(chǎn)生H2S;分離菌株用ATB 自動生化儀鑒定為沙門菌,評定結(jié)果合格率在98.9%～99.9%之間。

2.3 細菌的16S rRNA PCR 擴增與測序 分離菌株用細菌16S rRNA 通用引物進行PCR 擴增,結(jié)果顯示,分離菌株擴增出大約1 492 bp 的目的條帶(見圖1),分離菌株測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中登錄的10 株沙門菌參考菌株基因序列同源性在99.9%～100.0%之間。從分子生物學(xué)基礎(chǔ)證實了分離菌株為沙門菌。

圖1 分菌株P(guān)CR 擴增結(jié)果

2.4 致病性試驗結(jié)果 試驗組小鼠在攻毒后的24～48 h,小鼠出現(xiàn)精神沉郁、厭食,3 只小鼠嚴(yán)重腹瀉癥狀,至試驗第4 天,試驗組的小鼠全部死亡。剖檢死亡的小鼠,無菌采集肝臟進行分離鑒定,結(jié)果顯示,在死亡的小鼠的體內(nèi)分離到沙門菌,對照組小鼠健康存活,因而證實分離菌株為致病性沙門菌。

2.5 藥敏試驗 藥敏試驗結(jié)果見(表1),分離菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、恩諾沙星、氟苯尼考、阿米卡星5 種藥物高度敏感;對環(huán)丙沙星、頭孢他定、大觀霉素、多粘菌素4 種藥物中度敏感;對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、新霉素、多西環(huán)素、林可霉素、青霉素7 種藥物耐藥。

表1 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

沙門菌是一種人獸共患的條件性病原菌,是引起多種家畜家禽及人腹瀉的重要病原菌之一,該菌通過消化道、呼吸道等多種途徑感染宿主,感染宿主后該菌在動物的腸道內(nèi)進行定植、生長、繁殖,產(chǎn)生大量的毒素,造成嚴(yán)重的腹瀉,產(chǎn)生的毒素再通過動物的腸道上皮細胞進入體內(nèi),血液循環(huán)進入全身的組織器官,引起動物的菌血癥,嚴(yán)重的出現(xiàn)敗血癥[1]。帶菌動物和隱形感染的動物是沙門菌主要的傳染源,可以長期帶毒和排毒,該菌可以通過水平傳播方式傳播,因此,導(dǎo)致沙門菌病廣泛發(fā)生與流行[2]。喻華英等[3]報道了在腹瀉致死的羔羊體內(nèi)分離出致病性沙門菌。本試驗研究顯示,從35 日齡的腹瀉羔羊中分離出1 株沙門菌,致病性試驗顯示,分離株具有很強的致病性。沙門菌是一種條件病原菌,當(dāng)外界條件改變時,如冷熱交替、突然換料、衛(wèi)生條件較差等應(yīng)激因素,可以致使羊機體防衛(wèi)機能下降,引發(fā)沙門菌病的發(fā)生與流行,在養(yǎng)羊過程中應(yīng)引起重視。

沙門菌具有多種血清型,并易產(chǎn)生耐藥性,該菌的耐藥性在不同菌株及不同血清型之間傳播,對不同菌株造成嚴(yán)重耐藥性,該菌的耐藥性可以多種途徑傳播給人類,給人類的健康造成嚴(yán)重的威脅[4]。本試驗結(jié)果顯示,分離菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、恩諾沙星等5 種藥物高度敏感;對環(huán)丙沙星、頭孢他定、大觀霉素等4 種藥物中度敏感;對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素等7 種藥物耐藥。江萍等報道了分離的沙門菌對諾氟沙星、卡那霉素、阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、四環(huán)素等藥物耐藥性嚴(yán)重[5]。當(dāng)發(fā)生該病時,應(yīng)進行藥敏試驗選擇敏感藥物,合理用藥,提高治療效果。同時加強平時的飼養(yǎng)管理和注意環(huán)境的消毒,減少環(huán)境的誘因。