低深度全基因組測(cè)序拷貝數(shù)變異檢測(cè)技術(shù)對(duì)缺失型X連鎖魚鱗病的檢測(cè)效力及意義的分析研究

白周現(xiàn) 陳晨 蘇利沙 徐慧 王聰慧 時(shí)盼來(lái) 孔祥東

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心 450000

魚鱗病是一組皮膚角化障礙性疾病，主要表現(xiàn)為四肢伸側(cè)或軀干部皮膚干燥、粗糙，伴有菱形或多角形魚鱗狀脫屑，多為遺傳因素所致。X連鎖魚鱗?。╔-linked ichthyosis，XLI）由類固醇硫酸酯酶基因（STS）缺失或突變引起，鱗屑顏色深淺不一，深棕色鱗屑患者約占70%，淺灰色鱗屑患者占30%［1］。男性 XLI 發(fā)病率為 1/1 300 ～ 1/1 500［2］。85% ～90% XLI 病例為包括 STS 基因在內(nèi)的Xp22.31 片段缺失型，其余為STS 單基因突變型［3］。一般通過(guò)高通量測(cè)序、定量PCR（qPCR）及Sanger測(cè)序等進(jìn)行XLI的遺傳診斷。我們通過(guò)分析鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年所有進(jìn)行拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）檢測(cè)的案例，探討低深度全基因組測(cè)序CNV 檢測(cè)技術(shù)（CNV-Seq）在缺失型XLI遺傳診斷和產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2018全年于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行CNV 檢測(cè)的 3 616 例受試者，其中孕婦 2 891 例，其他725 例，以及進(jìn)行魚鱗病單基因檢測(cè)的7 例魚鱗病患者或家系的表型資料和遺傳檢測(cè)結(jié)果。2 891例孕婦產(chǎn)前檢測(cè)樣本主要為羊水，部分為胎兒絨毛，極少數(shù)為臍血樣本，725例其他受試者檢測(cè)樣本為外周血。3 616例受試者中，6例孕婦的胎兒樣本檢出缺失型XLI 陽(yáng)性，這6 例受試者皆因魚鱗病家族史以外的臨床指征行羊水穿刺CNV檢測(cè)。經(jīng)詢問(wèn)魚鱗病家族史和臨床表現(xiàn)，6 個(gè)家系情況見圖1。本研究獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：KS-2018-KY-36），受試者簽署知情同意書后進(jìn)行采樣檢測(cè)，胎兒父母驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采集胎兒父母的外周血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

二、方法

1.羊水細(xì)胞和外周血DNA 提?。菏褂眉兓ǎ≦IAamp DNA Blood Mini Kit，德國(guó) QIAGEN 公司）提取羊水細(xì)胞基因組DNA。使用磁珠法提取試劑盒（Blood DNA Midi Kit D3494，美國(guó)Omega Bio-tek公司）和自動(dòng)化DNA提取設(shè)備（艾本德中國(guó)有限公司）抽提外周血基因組DNA。

2.CNV-Seq檢測(cè)：使用商品化CNV檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司），通過(guò)本科室Illumina 測(cè)序平臺(tái)NextSeq 500 檢測(cè)CNVs。測(cè)序類型SE45（單端測(cè)序，讀長(zhǎng)45 bp），平均測(cè)序深度0.1X。人類基因組參考序列版本選擇GRCh37（UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)，http：//genome.ucsc.edu/cgibin/hgGateway）。采用 Tattini 等［4］的 CNV 檢測(cè)算法分析測(cè)序數(shù)據(jù)，檢出CNVs分辨率為100 kb以上。

3.qPCR 法驗(yàn)證 CNV：以 5 例孕婦羊水、1 例攜帶者母親、1 例健康女性對(duì)照的基因組DNA 為模板，采用GeneTool 軟件自行設(shè)計(jì)的特異引物（表1）和熒光定量試劑盒（KAPA SYBR?FAST Universal kit，美國(guó)Kapa Biosystems公司）于QuantStudio5 PCR儀（美國(guó)ThermoFisher 公司）對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。STS基因共10個(gè)外顯子，選取第1、5、10外顯子代表整個(gè)基因。

4.染色體微陣列法驗(yàn)證CNV：使用Affymetrix平臺(tái)Cyto Scan 750k型號(hào)芯片獨(dú)立驗(yàn)證檢出的CNV。750k芯片包含兩種設(shè)計(jì)原理的探針：200 436個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）探針和550 000個(gè)CNV探針，分別采用SNP 微陣列和比較基因組雜交（CGH）微陣列原理。應(yīng)用配套軟件ChAS-3.2 分析微陣列原始數(shù)據(jù)。

5.CNV 致病性分析：CNVs 的注釋分析主要參考人群多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)DGV（database of genomic variants，http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、病例數(shù)據(jù)庫(kù) DECIPHER（database of genomic variation and phenotype in humans using ensembl resources，https：//decipher.sanger.ac.uk）和人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM（online Mendelian inheritance in man，https：//omim.org）。同時(shí)參考基因劑量效應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù) ClinGen（clinical genome resource，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen）分析拷貝數(shù)缺失、重復(fù)的意義。

6.7 例魚鱗病患者或家系的CNV 檢測(cè)：對(duì)2018 年收集的7 例魚鱗病患者使用魚鱗病基因包（panel）引物混合物（由北京邁基諾基因科技股份有限公司合成）靶向捕獲測(cè)序技術(shù)，通過(guò)本中心Illumina NextSeq 500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，人類基因組參考序列版本選擇GRCh37。經(jīng)基因靶向捕獲測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其中2例為缺失型XLI患者，對(duì)這2例患者進(jìn)行CNV-Seq 檢測(cè)以分析染色體片段CNV情況，驗(yàn)證CNV-Seq檢測(cè)技術(shù)在該單基因遺傳病中的診斷意義。

結(jié) 果

一、CNV-Seq檢測(cè)

3 616 例受試者CNV 檢測(cè)全部成功，成功率為100%，檢測(cè)結(jié)果顯示，6 例（1.66‰）Xp22.31 缺失（含STS主效基因），見表2。經(jīng)家系驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其中2 例（家系1、2）為自發(fā)突變，1 例（家系5）為父源遺傳，3 例（家系3、4、6）為母源遺傳；家系1、2、3、5、6的胎兒羊水Xp22.31缺失結(jié)果和家系4孕婦的驗(yàn)證結(jié)果見圖2。

2018 年在我院進(jìn)行CNV 檢測(cè)的3 616 例受試者中發(fā)現(xiàn)Xp22.31重復(fù)（與Xp22.31缺失相同位置，含STS 主效基因）16 例（4.42‰），包括11 例女性為Xp22.31 三倍重復(fù)，5 例男性為 Xp22.31 二倍重復(fù)（圖3）。16例Xp22.31重復(fù)案例中4例為正常表型成人或兒童，12例為胎兒，其中5例Xp22.31重復(fù)胎兒進(jìn)行了父母來(lái)源驗(yàn)證，結(jié)果均遺傳自正常表型父親或母親。

二、qPCR法驗(yàn)證CNV檢測(cè)結(jié)果

圖1 6個(gè)X連鎖魚鱗?。╔LI）家系譜圖 家系5中Ⅲ3為貓叫綜合征患兒；家系1、2只追蹤到2代人，受試者經(jīng)隨訪否定魚鱗病家族史

表1 定量PCR（qPCR）中類固醇硫酸酯酶（STS）基因外顯子的引物設(shè)計(jì)

表2 6個(gè)X連鎖魚鱗?。╔LI）家系Xp22.31缺失拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)結(jié)果

圖2 6個(gè)X連鎖魚鱗病（XLI）家系致病缺失區(qū)域拷貝數(shù)變異（CNV）測(cè)序結(jié)果 A、B、C、D、E分別為家系1（胎兒Ⅱ2）、5（胎兒Ⅲ4）、2（胎兒Ⅱ1）、3（胎兒Ⅲ1）、6（胎兒Ⅳ1）的產(chǎn)前診斷結(jié)果，F(xiàn) 為家系4 的孕婦驗(yàn)證結(jié)果，紅色方框內(nèi)為拷貝數(shù)異常區(qū)域，其他區(qū)域拷貝數(shù)正常，顯示Xp22.31片段缺失

圖3 拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)顯示部分受試者存在包含類固醇硫酸酯酶（STS）基因的Xp22.31 片段重復(fù)3A：女性受試者；3B：男性受試者，紅色方框內(nèi)為拷貝數(shù)異常區(qū)域，其他區(qū)域拷貝數(shù)正常，顯示Xp22.31片段重復(fù)

采用qPCR 法驗(yàn)證6 例產(chǎn)前CNV 檢測(cè)為Xp22.31缺失陽(yáng)性的結(jié)果，顯示家系5 Ⅲ4女性胎兒為STS 基因完全雜合缺失攜帶者，家系1、2、3、4、6中男性胎兒STS基因完全缺失。qPCR結(jié)果與CNV測(cè)序結(jié)果一致，見圖4。

三、染色體微陣列驗(yàn)證

選取家系5 中Ⅲ4 女性胎兒雜合Xp22.31 缺失攜帶者進(jìn)行SNP-CGH 染色體微陣列法驗(yàn)證，Affymetrix 750k 微陣列結(jié)果為 arr［hg19］Xp22.31（6 473 896-8 061 665）× 1，與CNV 測(cè)序結(jié)果一致，見圖5?？芍狢NV-Seq 技術(shù)對(duì)CNV 檢測(cè)可以達(dá)到與傳統(tǒng)芯片技術(shù)一樣的效力。

四、CNV致病性分析

圖4 定量PCR 驗(yàn)證6 例產(chǎn)前拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)診斷Xp22.31 缺失陽(yáng)性胎兒的類固醇硫酸酯酶（STS）基因缺失情況1 ～ 6分別為家系1（胎兒Ⅱ2）、5（胎兒Ⅲ4）、2（胎兒Ⅱ1）、3（胎兒Ⅲ1）、6（胎兒Ⅳ1）和4（胎兒Ⅲ1）；家系5 Ⅲ4女性胎兒為STS基因完全雜合缺失攜帶者，家系1、2、3、4、6中男性胎兒STS基因完全缺失

本研究檢出的6 例Xp22.31 缺失片段大小從500 kb至1.7 Mb，均含有XLI的STS主效基因，另有若干其他無(wú)明確致病意義的OMIM 基因。CNV 人群多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)DGV（截至2019年7月25日）未收錄Xp22.31缺失案例，病例數(shù)據(jù)庫(kù)DECIPHER（更新至 2018 年 5 月 23 日）收錄了 3 例 Xp22.31 缺失致病的病 例 ，這些 病例（DECIPHER ID：326575，289553，326575）均表現(xiàn)為先天性魚鱗病且致病性明確。本研究檢出的Xp22.31 缺失片段覆蓋DECIPHER收錄的STS缺失型XLI綜合征區(qū)域。根據(jù)基因劑量效應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)ClinGen 記錄，STS 為單倍劑量不足效應(yīng)（haploinsufficiency）基因，具有足夠的劑量致病性證據(jù)（haploinsufficiencyscore 3）。因此，判斷Xp22.31缺失（含STS）為致病性CNV。

本研究同時(shí)也檢出16 例Xp22.31 重復(fù)，與Xp22.31 缺失位置相同，大小約1.6 Mb。DGV 數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄Xp22.31 重復(fù)案例，DECIPHER 數(shù)據(jù)庫(kù)亦無(wú)類似明確致病的案例收錄。無(wú)證據(jù)表明STS 為3 倍 劑 量 敏 感 效 應(yīng)（triplosensitivity）基 因（triplosensitivityscore 0）。16 例 Xp22.31 重復(fù)的男性和女性攜帶者均表型正常，經(jīng)家系驗(yàn)證的胎兒父母之一攜帶該重復(fù)亦表型正常。結(jié)合個(gè)體表型，分析認(rèn)為，Xp22.31重復(fù)為多態(tài)性變異的可能性大。

五、魚鱗病基因突變檢測(cè)情況

圖5 單核苷酸多態(tài)性-比較基因組雜交染色體微陣列法驗(yàn)證家系5女性胎兒產(chǎn)前拷貝數(shù)變異（CNV）診斷結(jié)果 5A：局部放大圖；5B：全局圖。紅色方框內(nèi)為拷貝數(shù)異常區(qū)域，其他區(qū)域拷貝數(shù)正常

2018 年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心7例魚鱗病患者的魚鱗病基因panel 檢測(cè)結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，丑角樣魚鱗病1例，尋常型魚鱗病2 例，XLI 3 例，未找到致病基因突變1 例。對(duì)缺失型 XLI 患者 5 和患者 7 行 CNV 測(cè)序分析，顯示2例患者均存在基因拷貝數(shù)異常，患者5的Xp22.31（6 480 000-7 860 000）存在1.38 Mb半合子缺失（含STS基因），患者7的Xp22.31（6 820 000-7 720 000）存在0.9 Mb半合子缺失（含STS基因），見圖6。

討 論

通常情況下對(duì)魚鱗病的遺傳診斷采用皮膚病相關(guān)基因panel，通過(guò)靶向捕獲高通量測(cè)序法進(jìn)行致病基因突變篩查［6］。2015 年有研究者［7］通過(guò)CNV-Seq 法檢測(cè)到母體X 染色體Xp22.31 片段（含STS 基因）拷貝數(shù)異常與無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前DNA 檢測(cè)技術(shù)（NIPT）檢測(cè)到的胎兒性染色體非整倍體假陽(yáng)性有關(guān)。我們通過(guò)對(duì)本中心CNV 檢測(cè)結(jié)果中含STS 基因Xp22.31 片段缺失陽(yáng)性案例的整理，探討CNVSeq 檢測(cè)技術(shù)對(duì)STS 缺失型XLI 的診斷適用性和意義。

本中心2018 年3 616 例進(jìn)行CNV 檢測(cè)的受試者中，共檢出6例Xp22.31片段缺失陽(yáng)性，其中男性胎兒5例、女性胎兒1例。CNV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的6個(gè)XLI家系，皆因無(wú)魚鱗病在內(nèi)的臨床指征不適合作單基因病遺傳診斷，而行產(chǎn)前篩查或診斷，經(jīng)電話隨訪獲知家系5 和家系6 有魚鱗病家族史，其余4 個(gè)家系均否認(rèn)家族史。經(jīng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，家系1和家系2 為胎兒自發(fā)突變，其余4 個(gè)家系為親代遺傳。其中家系5 因貓叫綜合征患兒生育史而做產(chǎn)前診斷，該胎兒經(jīng)CNV 檢測(cè)排除貓叫綜合征患病可能性，意外發(fā)現(xiàn)為魚鱗病Xp22.31片段缺失攜帶者。這6 個(gè)XLI 家系胎兒，其中4 例因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)提示X 染色體異?？赡芏醒蛩┐坍a(chǎn)前診斷，另2 例因其他不良生育史或唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)而行產(chǎn)前診斷。CNV-Seq 檢出的XLI陽(yáng)性結(jié)果與qPCR和SNP-CGH微陣列2種方法獨(dú)立驗(yàn)證結(jié)果一致，這與以往研究［8］認(rèn)為全基因組測(cè)序法檢測(cè)拷貝數(shù)異常的可靠性符合。此外，在這3 616例行CNV檢測(cè)的受試者中，我們發(fā)現(xiàn)Xp22.31 重復(fù)（含STS 基因）攜帶率4.42‰，綜合分析認(rèn)為，該片段重復(fù)為多態(tài)性變異。因此，CNV-Seq 檢測(cè)技術(shù)可應(yīng)用于缺失型XLI的基因診斷及產(chǎn)前診斷，并且該技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)全基因組范圍內(nèi)的拷貝數(shù)異常進(jìn)行篩查。

本中心2018 年7 例因魚鱗病進(jìn)行遺傳學(xué)診斷的案例中，有 3 例 STS 基因突變致 XLI，其中 2 例為STS完全缺失型。在這7例魚鱗病患者中，我們發(fā)現(xiàn)了3 例新發(fā)候選致病性變異，其中患者1 為引產(chǎn)胎兒，外院根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷為魚鱗病，本中心檢測(cè)到高度相關(guān)的ABCA12基因c.490delA（p.I164Ffs*8）移碼突變和39-42 號(hào)外顯子缺失組合的復(fù)合雜合突變，依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）指南［9］，判斷為致病性變異（等級(jí)PVS1），但該突變的致病性仍需進(jìn)一步的功能驗(yàn)證或家系攜帶驗(yàn)證?；颊? 為絲聚合蛋白（FLG）基因c.10969C＞T（p.R3657X）和c.3321delA（p.G1109Efs*13）［5］復(fù)合雜合突變導(dǎo)致的尋常型魚鱗病，其中p.R3657X 無(wú)義突變?yōu)樾掳l(fā)變異且具致病性（等級(jí)PVS1）；患者6存在 STS 基因 c.923A＞G（p.Y308C）錯(cuò)義突變導(dǎo)致XLI 的可能性。應(yīng)用CNV-Seq 技術(shù)對(duì)STS 缺失型XLI 患者進(jìn)行遺傳診斷得到的結(jié)果與基因Panel 測(cè)序法一致。

表3 2018年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心7例魚鱗病患者基因診斷概況

圖6 缺失型X連鎖魚鱗病（XLI）患者5和患者7拷貝數(shù)變異（CNV）測(cè)序 紅色方框內(nèi)為拷貝數(shù)異常區(qū)域，其他區(qū)域拷貝數(shù)正常，患者5和7存在Xp22.31片段缺失

XLI 是一種較為常見的皮膚角化障礙性疾病，STS缺失型為該病的主要致病形式。缺失型XLI具有臨床表現(xiàn)異質(zhì)性，魚鱗病皮損表現(xiàn)從輕微到嚴(yán)重程度不一，極少數(shù)可能會(huì)合并其他全身癥狀。缺失型XLI 的產(chǎn)前基因檢測(cè)能夠?qū)υ摬≡谔浩谶M(jìn)行及早診斷，但由于該病的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性，相關(guān)遺傳咨詢需謹(jǐn)慎。對(duì)有遺傳家族史的胎兒可結(jié)合家系內(nèi)患者表型綜合分析，對(duì)新發(fā)突變的受檢胎兒應(yīng)對(duì)孕婦進(jìn)行充分的風(fēng)險(xiǎn)告知。

總之，本研究探討了CNV-Seq檢測(cè)技術(shù)在缺失型XLI 的基因診斷及產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的可靠性以及檢出情況。報(bào)告了新的單中心XLI相關(guān)Xp22.31片段缺失的人群頻率（1.66‰）和相同位置的Xp22.31 片段重復(fù)的人群頻率（4.42‰），綜合分析認(rèn)為Xp22.31片段重復(fù)為多態(tài)性變異。CNV-Seq技術(shù)能夠穩(wěn)定、可靠、快捷地檢出缺失型XLI變異，為XLI的診斷及遺傳咨詢提供了新途徑。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突