花生新黑地珠蚧發(fā)生為害及其系統(tǒng)發(fā)育

李紹建 王娜 崔小偉

摘要 本文以花生地下害蟲花生新黑地珠蚧為研究對象，對其田間危害及蟲體發(fā)育情況進行了調(diào)查，并利用分子生物學技術(shù)對其進行系統(tǒng)發(fā)育研究。田間調(diào)查結(jié)果表明，花生新黑地珠蚧在河南省一年發(fā)生一代，多發(fā)生于沙壤土，主要以珠體狀的2齡若蟲為害花生根部;雌雄珠體數(shù)量及大小差異均較大，單株花生上為害的雌珠體數(shù)17～78頭，雄珠體數(shù)59～146頭，雌雄珠體性比為1.00∶2.61，雌雄珠體直徑分別為4.72～7.26 mm和1.83～2.65 mm。通過系統(tǒng)發(fā)育分析和傳統(tǒng)形態(tài)學分類的綜合分析表明本研究中所采集害蟲為花生新黑地珠蚧，隸屬于半翅目蚧總科珠蚧科。

關(guān)鍵詞 花生新黑地珠蚧; 田間為害; 蟲體發(fā)育; 系統(tǒng)發(fā)育分析; 珠蚧科

中圖分類號： S 435.652 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018400

Abstract This study aims to investigate the field hazard and development of Neomargarodes gossypii， and reconstruct the phylogenetic relationship among different families. Field survey indicated that N.gossypii occurred one generation per year in Henan province which fed on the roots of peanut by its pearl shaped 2nd-instar nymph， and preferred sandy soil habitats. There were large differences on the amount and size between female and male pearl. The amount of female and male pearl per peanut was 17～78 and 59～146， respectively and the sex ratio was 1.00∶2.61. The diameters of female and male pearl were 4.72～7.26 mm and 1.83～2.65 mm， respectively. Through comprehensive analysis of phylogenetic tree and morphological classification， the samples collected in Henan peanut fields were identified as N.gossypii that belongs to Margarodidae （Hemiptera： Coccoidea）.

Key words Neomargarodes gossypii; field hazard; development; phylogenetic analysis; Margarodidae

花生新黑地珠蚧Neomargarodes gossypii Yang，屬半翅目Hemiptera蚧總科Coccoidea珠蚧科Margarodidae[1]，在我國華中、華東、華北及西北地區(qū)均有發(fā)生，是一種嚴重為害花生的地下害蟲[2-5]。該蟲主要以2齡若蟲聚集在花生根部刺吸根系汁液為害，導致根系衰弱，側(cè)根減少，進而花生生長不良，結(jié)果少而癟或不結(jié)果，嚴重影響花生產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。據(jù)調(diào)查，一般田塊可造成花生減產(chǎn)20%～30%，嚴重田塊可達50%以上，甚至絕收[7]。近年來，花生新黑地珠蚧的為害越來越嚴重，已成為制約我國花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大阻礙。

新黑地珠蚧又名烏黑新珠蚧，其最早于1912年由英國學者Green作為新種以Margarodes niger的拉丁學名發(fā)表，并將其歸類至珠蚧屬Margarodes下，1928年Morrison將該蟲歸類至新珠蚧屬Neomargarodes下，并沿用拉丁文種名niger[8]。我國學者侯璋德等首次將為害我國花生的珠蚧定為烏黑新珠蚧Neomargarodes niger （Green）[9]，隨后此名稱被多名學者沿用。1979年，楊集昆先生通過對各地為害花生的新珠蚧標本進行對比鑒定，確定為害我國棉花、豆類等作物的新珠蚧是新種，應(yīng)為棉根新珠蚧Neomargarodes gossypii Yang，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，該珠蚧主要為害豆科植物且能完成生活史，卻不能在棉花上完成生活史，因此建議將其中文名改為花生新珠蚧[1]。目前，國內(nèi)學者習慣將其稱之為花生新黑地珠蚧[4-5]。

截至目前，國內(nèi)學者對花生新黑地珠蚧的研究相對較少，且主要集中于對其生物學特性及防治方法的研究，未見其系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)報道，國外更是鮮有關(guān)于花生新黑地珠蚧的相關(guān)研究。為了更好地了解花生新黑地珠蚧的發(fā)生為害及其系統(tǒng)發(fā)育，我們對其田間危害及蟲體發(fā)育情況進行了調(diào)查并利用分子生物學技術(shù)對其進行系統(tǒng)發(fā)育分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 田間調(diào)查

選取有花生新黑地珠蚧發(fā)生的田塊，調(diào)查其為害花生的癥狀及花生受害情況，同時定期調(diào)查花生各發(fā)育期及收獲期后田間花生新黑地珠蚧的發(fā)生發(fā)展情況。

1.2 樣本采集

于田間花生新黑地珠蚧高發(fā)期，在河南省開封市和濮陽市分別選取受害嚴重的地塊采集花生新黑地珠蚧珠體，分地域標記記錄后帶回室內(nèi)。

1.3 花生新黑地珠蚧基因組DNA提取

將田間采集的花生新黑地珠蚧珠體放入玻璃培養(yǎng)皿中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，15 d左右后雌珠體可羽化出成蟲; 收集單頭雌成蟲于滅菌1.5 mL PE離心管內(nèi)，每管加入3 μL STE （0.1 mol/L NaCl; 10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0; 1 mmol/L EDTA，pH 8.0）裂解液及滅菌小玻璃珠若干，于Bullet Blender STORM研磨儀（Next Advance）上研磨至勻漿，每管補足裂解液至30 μL并加入0.2～0.3 μL蛋白酶K，56℃恒溫水浴裂解2～3 h，然后95℃水浴10 min滅活蛋白酶K，短暫離心，吸取每管內(nèi)DNA溶液于新的滅菌1.5 mL PE離心管，分別標記后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 花生新黑地珠蚧序列擴增及測定

花生新黑地珠蚧的序列擴增選取核糖體小亞基（18S）基因[10]、核糖體大亞基（28S）基因的D2和D10擴展區(qū)域[11-12]以及蛋白編碼延伸因子1α（EF-1α）基因[13]，各序列擴增引物信息見表1。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 12 μL，ddH2O 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），模板DNA 1 μL。擴增程序為： 94℃預變性4 min; 94℃變性45 s，57℃（18S）/56℃（28S-D2）/62℃（28S-D10）/55℃（EF-1α）退火30 s，72℃ 延伸1 min，30個循環(huán); 72℃延伸5 min，4℃保存。取4 μL PCR擴增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，將含有目的片段的PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生新黑地珠蚧田間為害

花生新黑地珠蚧喜干燥疏松的沙土或沙壤土，在黃壤土、黏壤土中發(fā)生較輕或不發(fā)生。該蟲主要以1～2齡若蟲聚集在花生根部，大量刺吸花生汁液，造成花生主根發(fā)黑，側(cè)根減少，甚至腐爛，植株嚴重矮化，葉片自下而上褪綠發(fā)黃甚至整株花生干枯死亡，花生結(jié)果少而癟，甚至不結(jié)果。將受害花生植株連根拔起，可見大量2齡珠體吸附于根部，花生新黑地珠蚧在田間常成片發(fā)生，且為害嚴重（圖1a，圖1b）。

2.2 花生新黑地珠蚧蟲體發(fā)育循環(huán)

通過對花生新黑地珠蚧在花生各發(fā)育期及收獲期后的定期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，花生新黑地珠蚧在河南省各發(fā)生地區(qū)均1年發(fā)生1代，以2齡若蟲在花生主根層土壤中越冬，2齡若蟲珠體狀，分深褐色和黑色兩種：大的為雌性，小的為雄性。4月初至5月下旬，2齡雄珠體先蛻殼變?yōu)?齡若蟲，然后變?yōu)榍坝?，再變?yōu)橛迹?月底至6月上旬蛹羽化變?yōu)樾鄢上x爬出地面。2齡雌珠體于4月底至6月初蛻殼變?yōu)榇瞥上x，爬上地面與雄成蟲交配產(chǎn)卵。5月中下旬至6月中下旬，卵孵化成為1齡若蟲，1齡若蟲部分爬出地面尋找花生寄主，部分直接在土壤中尋找花生根部，進而取食花生根部汁液，于7月上旬至8月下旬發(fā)育為大小不同的雌雄2齡珠體，聚集吸附在花生根部為害（圖1a，圖2）。

花生新黑地珠蚧雌成蟲交配后即爬回地下產(chǎn)卵，卵塊多分布于距地表10 cm左右，每個卵塊中卵粒數(shù)從110粒到1 058粒不等，單株花生根上為害的花生新黑地珠蚧雌珠體數(shù)17～78頭，雄珠體數(shù)59～146頭，花生新黑地珠蚧卵及珠體數(shù)量詳見表2。同一株花生根部為害的花生新黑地珠蚧雄珠體數(shù)量明顯多于雌珠體數(shù)量，雌雄性比平均為1.00∶2.61。2齡雌雄珠體大小相差較大，雌珠體直徑4.72～7.26 mm，平均6.27 mm，雄珠體直徑1.83～2.65 mm，平均2.30 mm（表3）。

2.3 花生新黑地珠蚧系統(tǒng)發(fā)育

本研究中所測河南省開封（KF）和濮陽（PY）的花生新黑地珠蚧18S、28S-D2、28S-D10和EF-1α基因序列分別上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得登錄號：開封的花生新黑地珠蚧18S、28S-D2、28S-D10和EF-1α的GenBank登錄號分別為MH051908、MH133216、MH133218和MH230870; 濮陽的花生新黑地珠蚧18S、28S-D2、28S-D10和EF-1α的GenBank登錄號分別為MH051909、MH133217、MH133219和MH230871。

為更加準確地分析花生新黑地珠蚧的系統(tǒng)發(fā)育，將所測得的兩個地區(qū)花生新黑地珠蚧的18S、28S-D2、28S-D10和EF-1α的序列分別用Geneious軟件（11.1.4）進行串接。同時，利用GenBank數(shù)據(jù)庫中蚧總科內(nèi)其他科屬的串接序列，以粉蚧科Pseudococcidae為外群，利用MEGA 6.0軟件[14]，采用Kimura 2-parameter距離模型[15]，鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹各分支置信度（bootstrap）均進行1 000次重復檢驗（圖3），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的其他不同物種序列GenBank登錄信息見表4。從圖3的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，采自河南省開封（KF）和濮陽（PY）的兩個珠蚧種群與紅珠蚧Eumargarodes laingi聚為一支（bootstrap值=1 000），同屬于珠蚧科Margarodidae。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對花生新黑地珠蚧的田間發(fā)生為害調(diào)查，已基本摸清該蟲在田間的為害時期、為害特征、蟲體發(fā)育循環(huán)等特性?；ㄉ潞诘刂轵恢饕诤幽鲜【硟?nèi)黃河故道及黃泛區(qū)區(qū)域內(nèi)的沙土及沙壤土中發(fā)生為害，這與馬鐵山等關(guān)于花生新黑地珠蚧主要發(fā)生在沙質(zhì)土壤，在黏土和壤土中未見有發(fā)生的調(diào)查結(jié)果一致[16]?；ㄉ潞诘刂轵淮瞥上x需鉆入土中產(chǎn)卵，卵孵化出的1齡若蟲需鉆出地面找尋花生寄主并鉆入地下取食為害花生根部，沙土或沙壤土土質(zhì)疏松的特性有利于花生新黑地珠蚧成蟲和若蟲的活動和入土。本研究前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，開封地區(qū)花生新黑地珠蚧各蟲態(tài)發(fā)育時期均比濮陽地區(qū)花生新黑地珠蚧的各蟲態(tài)發(fā)育時期稍早，如開封地區(qū)4月底5月初花生新黑地珠蚧2齡雌珠體即蛻殼為雌成蟲爬上地表，而濮陽地區(qū)這一時間則要稍錯后至5月中下旬，由于濮陽地處豫北，我們推測可能是由于地域上的南北溫度差異造成開封地區(qū)蟲體發(fā)育的提前，這一推測與馬鐵山等對濮陽地區(qū)花生新黑地珠蚧生物學特性的研究及馬鐵山對不同溫度條件下花生新黑地珠蚧發(fā)育歷期的影響結(jié)果是一致的[6， 16]。

本研究中，根據(jù)所采集的珠體及卵塊的形態(tài)特征，田間初步認定為珠蚧科昆蟲。結(jié)合武三安先生對于花生新黑地珠蚧的形態(tài)特征描述[1]，我們在室內(nèi)利用分子生物學方法對其進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，綜合分析后確定本文研究對象確為花生新黑地珠蚧，系統(tǒng)進化分析結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學分類結(jié)果相互佐證并保持一致。

近年來，花生新黑地珠蚧在河南省的發(fā)生越來越嚴重，其整個發(fā)育過程中大部分時間均生活在地下，這給生產(chǎn)上采用化學藥劑防治提出了很大挑戰(zhàn)。本研究中對花生新黑地珠蚧蟲體發(fā)育的研究表明，其卵孵化為1齡若蟲后需爬回地表進行寄主搜尋，這一時期在地表活動的1齡若蟲易接觸藥劑，因此可作為花生新黑地珠蚧的防治適期，此時期可選用適宜藥劑進行噴霧并輔以花生根部噴淋進行防治。

參考文獻

[1] 武三安.花生新珠蚧的學名考證（半翅目：蚧總科：珠蚧科）[J].昆蟲分類學報，2007，29（3）：199-204.

[2] 柴曉娟，王改云，楊紅麗，等.花生新珠蚧生物學特性觀察及防治技術(shù)研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2004（5）：98-99.

[3] 付東，任英，楊寬林，等.花生新黑地珠蚧的發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)[J].植物檢疫，2006，20（6）：350-351.

[4] 常春梅，苗連河，苗奎領(lǐng).花生新黑地珠蚧在豫北的為害特點與綜合治理技術(shù)[J].中國植保導刊，2012，32（4）：33-34.

[5] 劉艾英，嚴攀，張煥玲，等.花生新黑地珠蚧生物學特性研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2015，61（5）：38-41.

[6] 馬鐵山.花生新珠蚧發(fā)育起點溫度和有效積溫研究[J].植物保護，2009，35（3）：60-62.

[7] 任應(yīng)黨，申效誠，劉玉霞，等.花生新珠蚧的生物學特性及防治研究[J].華北農(nóng)學報，2001，16（植物保護專輯）：48-52.

[8] JAKUBSKI A W.A critical revision of the families Margarodidae and Termitococcidae （Hemiptera：Coccoidea）[M].London：Trustees of the British museum （Natural history），1965：57-81.

[9] 侯璋德，孫元峰，張異，等.新黑地珠蚧為害花生的初步研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報，1985（1）：58-61.

[10] VON DOHLEN C D，MORAN N A.Molecular phylogeny of the Homoptera：a paraphyletic taxon [J].Journal of Molecular Evolution，1995，41：211-223.

[11] BELSHAW R，QUICKE D L J.A molecular phylogeny of the Aphidiinae （Hymenoptera：Braconidae）[J].Molecular Phylogenetics and Evolution，1997，7：281-293.

[12] DIETRICH C H，RAKITOV R A，HOLMES J L，et al.Phylogeny of the major lineages of Membracoidea （Insecta： Hemiptera： Cicadomorpha） based on 28S rNDA sequences [J].Molecular Phylogenetics and Evolution，2001，18：293-305.

[13] CHO S，MITCHELL A，REGIER J C，et al.A highly conserved nuclear gene for low-level phylogenetics：elongation factor 1-alpha recovers morphology-based tree for heliothine moths [J].Molecular Biology and Evolution，1995，12：650-656.

[14] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J].Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[15] YANG Ziheng.Estimating the pattern of nucleotide substitution[J].Journal of Molecular Evolution，1994，39（1）：105-111.

[16] 馬鐵山，郝改蓮，趙香云，等.濮陽地區(qū)花生新黑地珠蚧生物學特性及化學防治方法[J].中國植保導刊，2008，28（3）：18-20.

（責任編輯： 楊明麗）