分子對接技術在昆蟲化學感受研究中的應用進展

李敏 郭美琪 相偉芳

摘要 分子對接是利用生物信息分析手段預測配體和受體的結構模型，模擬出配體復合物的結構并通過結合自由能來判斷結合強度的一種技術。分子對接包括蛋白質和小分子的前期準備，識別結合位點，搜索配體化合物的構象，評估對接結果四部分。昆蟲的化學感受途徑主要通過化感蛋白與小分子化合物的結合，實現(xiàn)對化學信息素的接收。分子對接可以精確模擬昆蟲化感蛋白和信息化合物的結構以及二者的結合形式，可作為研究昆蟲化學感受途徑的有效技術手段，從而有利于研究開發(fā)昆蟲抑制劑，用于農林病蟲害的防治。本文綜述了分子對接技術在昆蟲化學感受研究中的應用進展，并詳細介紹了分子對接的相關軟件，舉例說明了分子對接的過程，可為該領域的相關研究提供理論支持和方法指導。

關鍵詞 分子對接; 昆蟲; 化學感受基因; 化學信息素; 配體復合物

中圖分類號： Q 965 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018464

Abstract Molecular docking is a technique for predicting the structural models of the ligands and receptors， simulating the structures of ligand complexes， and determining the strength of binding via combining free energies by means of bioinformatic analysis. Molecular docking involves the preparation of proteins and small molecules， the recognition of binding sites， the search for the conformation of ligand compounds， and the evaluation of the docking results. The reception of chemical pheromones by insects is mainly achieved by the combination of chemosensory proteins and small molecule compounds. Molecular docking accurately simulates the structures and the combined forms of insect chemosensory proteins and information compounds， which can be applied efficiently to the study of insect chemosensory pathways. This review summarized the research progresses in molecular docking technique in the field of insect chemosensory reception， introduced the related softwares of molecular docking， and illustrated the process of molecular docking， which provides solid theoretical supports and logical methodological guidance for the related research in this field.

Key words molecular docking; insect; chemosensory gene; chemical pheromone; ligand complexes

分子對接技術，即通過構建并優(yōu)化蛋白質與小分子化合物的三維結構，將小分子匹配到蛋白質的結合位點上，并評估結合力強弱的一種生物分析技術[1]。目前，分子對接應用于醫(yī)藥研發(fā)和生物大分子設計等方面，在昆蟲化學感受領域中，分子對接主要被應用于兩種小分子結合蛋白：氣味結合蛋白 （odorantbinding protein， OBP） 和化學感受蛋白（chemosensory protein， CSP） 的功能預測以及與小分子物質的結合中。研究昆蟲嗅覺和味覺感受蛋白的結合機制，對農林病蟲害的防治，利用天敵防治蟲害等工作有著很重要的意義。

1 分子對接的涵義

分子對接的理論最早可以追溯到Fisher 提出的“鎖-鑰模型”?！版i-鑰模型”將配體與受體的結合視為剛性過程，即在結合過程中，配體和受體的三維結構不發(fā)生改變。由于剛性對接本身的局限性，1958年Koshland 提出了“誘導契合學說”[2]，該學說認為在分子對接過程中，應將受體與配體視為柔性結構，即構象可以在一定范圍內發(fā)生改變以實現(xiàn)契合。隨著分子對接理論的進一步深入，目前在分子對接過程中常用半柔性對接作為對接方法，即在對接過程中，將受體構象視為剛性，而小分子構象可以在一定范圍內發(fā)生變化，此類對接比較適宜處理大分子與小分子之間的結合，例如蛋白質和配體之間的結合[3]。

2 分子對接的過程

分子對接的過程可以概括為四部分：1）蛋白質和小分子配體的準備，在進行分子對接之前，需在結構數(shù)據(jù)庫中搜索蛋白質和小分子配體的三維結構以進行后續(xù)操作。2）結合位點的識別，即在進行對接之前，需要識別蛋白質三維結構中可結合小分子的位點[1]。1994年， Collins 等第一次利用多尺度算法確定了蛋白質表面可結合配體的位點，并成功進行了柔性分子對接，促進了分子對接的發(fā)展[4]。3）配體化合物的構象搜索，即在分子對接過程中，由于分子結構具有一定的柔性，配體會相對于受體發(fā)生位置及結構的改變，因此，需要搜尋到所有的配體結構以及配體與受體的結合模式[5]。4）評估對接結果，即對構象搜索過程中，搜索到的大量配體復合物結構中配體的位置擺放的合理性和受體、配體結合的親和性進行評估，從而確定結合力強的配體復合物[6]。

精確識別結合位點，提高構象搜索能力，改善評估功能都有助于增強分子對接結果的準確性[7]。

3 蛋白質受體結構預測的技術進展

目前，X射線衍射，核磁共振已成為解析生物分子結構的兩大主要技術。X射線衍射研究常常是利用同步輻射的手段獲得蛋白質三維結構，更適合于較大分子量的樣品，核磁共振則適用于分子量相對較小的蛋白樣品[8-10]。這兩種技術經常聯(lián)合用于蛋白質結構的研究[11-12]。近年來，隨著冷凍電鏡技術興起，其逐漸被應用于解析生物大分子結構的研究中。冷凍電鏡技術能夠將生物大分子的靜態(tài)結構在原子級分辨率下進行解析[13]。由于生物大分子并不是穩(wěn)定不變的，常表現(xiàn)出亞穩(wěn)狀態(tài)，甚至會表現(xiàn)出連續(xù)構象變化的非平衡態(tài)，因此冷凍電子顯微鏡也具備了對生物大分子中的每一個子狀態(tài)進行動態(tài)解析的能力[14]。Joel等利用冷凍電鏡技術預測了榕小蜂Apocrypta bakeri的嗅覺系統(tǒng)中高度保守的Orco受體的三維結構[15]。隨著技術的發(fā)展，對蛋白質結構的了解更加深入，可以對蛋白質的三維構象進行更為準確的預測。

4 分子對接的應用

隨著分子對接的進一步發(fā)展，目前分子對接主要應用于醫(yī)藥研發(fā)以及生物大分子設計等方面，并日漸廣泛地應用于昆蟲化感基因領域的研究。

4.1 醫(yī)藥研發(fā)

利用分子對接可以預測小分子化合物和靶蛋白之間的結合親和力，因此，分子對接一經出現(xiàn)，就被迅速應用于醫(yī)藥研發(fā)領域[16-20]。分子對接技術不僅可以用于篩選化合物，還可用于虛擬篩選預測候選藥物的靶蛋白[21-22]。

在癌癥的治療中，微管蛋白抑制劑已被證明是一種消除癌細胞的有效策略[23]。研究人員利用AutoDock 4.2軟件，結合分子動力學模擬等相關技術，篩選出了新型微管蛋白抑制劑，對后續(xù)的研究提供了具有價值的抑制劑數(shù)據(jù)集[24]。

4.2 生物大分子設計

利用大分子物質和小分子配體的結合能力，可以設計出所需的生物大分子。目前，分子對接已經被廣泛應用于生物催化[25-26]、生物傳感器[27]以及生物降解[28]的研究中。

近年來，隨著納米技術的日益發(fā)展，納米復合材料也被廣泛應用于生物領域的研究中[29-31]。以蛋白質-聚電解質復合物形式的聚合物為基礎可以生產納米復合材料[32]。研究人員利用AutoDock Vina進行分子對接研究并構建了酶-聚電解質復合物模型，并將該模型應用于有機磷的現(xiàn)代解毒劑的研發(fā)中[33]。

4.3 昆蟲化學感受領域的應用

隨著多個物種基因組及轉錄組測序完成，昆蟲化學感受途徑機理的研究也取得了很大的進展[34]。研究昆蟲化學感受途徑有利于掌握昆蟲對信息化合物的接收機制，從而為深入研究昆蟲的嗅覺及味覺機制，研究開發(fā)害蟲抑制劑和利用益蟲新技術等提供理論支持[35]。

目前，分子對接技術被廣泛應用于化學感受途徑中重要的化學感受蛋白OBP和CSP與小分子結合的功能預測中。對于蛋白CSP的研究已經被應用于膜翅目蜜蜂科的中華蜜蜂Apis cerana Fabricius[36-39];半翅目粉虱科的煙粉虱Bemisia tabaci （Gennadius）[40]、蝽科[41]等類群的研究中。對于蛋白OBP的研究已經被應用于膜翅目蜜蜂科的中華蜜蜂Apis cerana[37]; 半翅目飛虱科的褐飛虱Nilaparvata lugens Stl [42]、蝽科[41]、蚜科[43];鱗翅目夜蛾科的斜紋夜蛾Spodoptera litura （Fabricius）[44-46]、螟蛾科的歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis（Hübner）[47]、菜蛾科的小菜蛾Plutella xylostella （Linnaeus）[48];直翅目蝗科的東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis （Meyen）[49];鞘翅目葉甲科[50]等類群的研究中。

5 分子對接技術常用軟件

分子對接技術常用軟件列于表1。

6 應用舉例

6.1 分子對接前蛋白質和小分子配體準備

6.1.1 蛋白質準備

6.1.1.1 同源建模

常用SWISSMODEL[57]，MODELLER 9.9[58]對蛋白質進行同源建模，在線提交蛋白的一級序列，以蛋白模型數(shù)據(jù)庫中同源蛋白的三維結構為模板來構建所需的蛋白模型，一般模型相似度達到30%及以上，便可獲得相對比較合理的構象[59]。

6.1.1.2 模型評估

經同源建模得到的蛋白質的三維結構，可通過兩種方式進行模型質量評估。1）利用Ramachandran plot（拉氏圖）進行評價[60]。拉氏圖用于闡述蛋白質或肽立體結構中肽鍵內α碳原子和羰基碳原子之間的鍵的旋轉度ψ對α碳原子和氮原子之間的鍵的旋轉度φ的關系，主要說明肽類或蛋白質的氨基酸的允許區(qū)和不允許區(qū)。很多軟件都可以生成Ramachandran plot，不同軟件生成的Ramachandran plot形式不同。一般落在允許區(qū)和最大允許區(qū)的氨基酸殘基占蛋白總體氨基酸殘基的比例高于90%，即可認為同源建模所得模型的構象合理[61]。2）對同源建模所得蛋白質結構模型還可以進行能量評價。利用PROSA（https：∥prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php），提交蛋白質三維結構的PDB文件，分析后顯示評價的結果圖像。評價結果會顯示出在PDB數(shù)據(jù)庫中所確定的與目標模型大小相似的蛋白結構鏈的Zscore，并形成一個分布區(qū)，若建模所得的模型的Zscore落在分布區(qū)內，即代表模型合理。一般Zscore為負值即為合理[52]。

圖1為懸鈴木方翅網(wǎng)蝽化學感受蛋白CcilCSP1經同源建模獲得的蛋白質結構模型的Ramachandran plot[62]。

在Ramachandran plot中，CcilCSP1經同源建模所得蛋白模型的94.7%的氨基酸殘基位于最大允許區(qū)，有5.3%的氨基酸殘基位于較合適區(qū)域，基本沒有氨基酸殘基落在勉強許可區(qū)和不合理區(qū)。另一方面，用PROSA評價得到Zscore打分為-6.26，落在了較好的結構蛋白的Zscore分布范圍。經兩種方法評估，CcilCSP1經同源建模獲得的模型構象合理[62]。

6.1.2 小分子準備

小分子配體結構的下載：小分子結構可以在pubchem （https：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 小分子數(shù)據(jù)庫中獲取[63]。

6.2 小分子結合位點的識別

將蛋白質三維結構的PDB文件導入Discovery Studio 4.5中，若晶體結構中不含有氫原子，則Chemistry/Hydrogens/Add進行加氫操作。在工具欄中，展開ReceptorLigand Interactions/Define and Edit Binding Site，單擊Define Site一欄下的From Receptor Cavities，通過尋找受體蛋白的“空腔”來尋找蛋白中可能結合小分子配體的位置。

6.3 配體復合物的構象搜索

由于Discovery Studio中的對接模塊為非開源部分，因此，利用Schrdinger 2015-2軟件包內的對接程序進行對接。將蛋白結構導入Schrdinger 2015-2，利用Maestro程序來觀察對接過程。Tasks/protein preparation，刪除蛋白質“空腔”內存在的水分子和雜原子基團，以保證蛋白受體和小分子配體對接充分，單擊Preprocess，蛋白質準備完成。Tasks/Docking/Gride Docking 對蛋白質上可能存在的小分子配體的結合位點進行坐標定義，并生成網(wǎng)格文件，此處可對照Discovery Studio中識別出的“空腔”位置進行定義。Tasks/Ligand preparation/LigPrep 在Schrdinger 2015-2中導入并優(yōu)化小分子結構，Task/Conformational search /Bioactive search/Standard，搜索小分子化合物可能存在的構象，以在對接過程中存在小分子所有三維構象。Task/Docking/Glide Docking 進行分子對接，搜索出所有可能存在的配體復合物的結構模型。

6.4 對接結果的評估

對接結束后，得到所有配體復合物的對接分數(shù)，其中Dockingscore為對接分數(shù)，數(shù)值越小，代表小分子配體與蛋白質結合程度越強。在沒有金屬存在的情況下，該數(shù)值應與Glidescore相一致。

選中與蛋白受體親和力最強的小分子配體粘貼到蛋白結構上，小分子自動填充至蛋白“空腔”內。單擊ReceptorLigand Interactions工具欄中的View Interactions，定義蛋白質和小分子配體，單擊Show receptorligand interactions on a 2D diagram 下的Show 2D Diagram 指令，即在新頁面中顯示配體-蛋白相互作用的二維平面圖，便于更加直觀地觀察受體和配體之間的相互作用以及關鍵的氨基酸基團。

7 分子對接技術準確性驗證

在利用分子對接技術對昆蟲化學感受基因相關的研究中常常運用分子動力學模擬[64]，熒光競爭結合分析[45，47]以及體外試驗等方法來驗證并進一步確認蛋白質和小分子配體的結合位點和結合強度。

為探索昆蟲氣味結合蛋白和小分子化合物識別過程，Xin等構建了斜紋夜蛾的氣味結合蛋白OBP1的三維結構，通過Discovery Studio 2.1進行OBP1與小分子配體的對接，并進行了熒光競爭結合試驗，熒光競爭結合分析結果與分子對接結果相同，驗證了分子對接技術結果的準確性[45]。

化學感受蛋白CSP在昆蟲化學感受途徑中起重要作用，為了探究昆蟲解毒和防御機制，Liu等以煙粉虱Bemisia tabaci為研究對象，測定編碼CSP1、CSP2和CSP3的基因序列，將CSP與可能相關基因的表達聯(lián)系起來，并試圖找到CSP1、CSP2和CSP3與真正的揮發(fā)性或非揮發(fā)性同源化學配體的相互作用。利用熒光競爭結合分析和分子對接技術進行研究，結果顯示CSP1與亞油酸的親和力較高，而CSP2和CSP3蛋白則與α戊基肉桂醛結合較好。在試驗中分子對接和熒光競爭結合分析的結果表現(xiàn)出了極大的一致性[40]。

8 挑戰(zhàn)及展望

雖然分子對接技術已經被廣泛應用到各種領域，但依舊面臨著巨大的挑戰(zhàn)。例如：1）許多蛋白結構尚未完全明確，缺乏用于建模的相關模型;2）評分函數(shù)過于簡單化，不能精確評估蛋白受體和配體間的相互作用。因此，構建更多的蛋白晶體結構，使得同源建模的模型精準度進一步提高，并在對接過程中，開發(fā)一種用來準確預測結合親和力并能夠同時篩選數(shù)據(jù)庫中成千上萬的分子的方法是亟待解決的任務[65]。

隨著大分子結構分析技術的豐富，蛋白質晶體結構的增加以及優(yōu)化，數(shù)據(jù)庫的進一步擴充，評分函數(shù)的進一步優(yōu)化，分子對接技術也將進一步革新，從而更具有準確性，將被廣泛應用于環(huán)境保護、蟲害防控以及利用昆蟲嗅覺機制開發(fā)新型抑制劑[66]。

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（責任編輯： 田 喆）