鹽酸小檗堿片微生物限度檢查方法研究

李東嫻 杜春華 張曉南 袁凡婷 王鵬 游燕

摘要：目的對鹽酸小檗堿片的微生物限度檢查進行了方法適用性研究。方法按《中國藥典》2015 年版通則1105，通則1106，通則1107。結果鹽酸小檗堿片應使用薄膜過濾法進行微生物限度檢查，而薄膜過濾法沖洗液中加入聚山梨酯-80作為助溶劑，提高沖洗液溫度（不超過45℃）等方法均可以對回收率的提高有一定作用，最終實驗采用1：100稀釋液薄膜過濾法對樣品進行檢測，回收率可達到藥典要求。結論該方法可以用于鹽酸小檗堿片的微生物限度檢查。

關鍵詞：鹽酸小檗堿片 微生物限度 方法適應性

中圖分類號：R286.0文獻標志碼：B文章編號：1007-2349（2019）10-0072-03

鹽酸小檗堿片的主要成分為鹽酸小檗堿，這是從黃連等植物中提取的一種異喹啉類生物堿，臨床上主要用于清熱解毒、治療腸道感染，近年發(fā)現還有治療心律失常、高血壓、高血脂、糖尿病和抗腫瘤等作用[1]。

鹽酸小檗堿屬于小檗堿類物質，小檗堿自1969年Amin等首次發(fā)現體外抑菌作用以來[2]，又在之后的實驗中被報道具有光譜的抗菌活性，對金黃色葡萄球菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，大腸桿菌等都表現出一定的抑菌作用[3-7]。

由于該藥品具有抗菌作用，所以很容易影響微生物檢測的結果，應按藥典要求對其進行微生物限度檢查方法適用性驗證。

1試驗材料

1.1樣品鹽酸小檗堿（云南省藥物研究所生產，共三批，XBJ201701，XBJ201702，XBJ201703）。

1.2稀釋劑及培養(yǎng)基pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基聚山梨酯-80，除聚山梨酯-80由國藥集團提供外，其余均由北京三藥提供。

1.3菌種金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003 第III代〕、大腸埃希菌〔CMCC（B）44 102 第IV代〕、枯草芽孢桿菌〔CMCC（B）63 501 第III代〕、銅綠假單胞菌〔CMCC（B）10 104 第III代〕和白色念珠菌〔CMCC（F）10 123 第III代〕均由云南省食品藥品檢驗所提供，黑曲霉[CMCC（B）98 003 第III代]，由中國藥品生物制品檢定所提供。

2試驗方法

參照《中國藥典》2015年版第四部非無菌產品微生物限度檢查（1105、1106）實驗，簡述如下：

2.1菌液制備接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30 ℃～35 ℃培養(yǎng)18～24 h。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20 ℃～25 ℃培養(yǎng)2～3 d。取接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20 ℃～25 ℃培養(yǎng)5～7 d。取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，之后用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子懸液稀釋成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

2.2方法摸索與優(yōu)化

2.2.1平皿法與培養(yǎng)基稀釋法（1）供試品制備：取供試品20 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 mL，制成1：10的供試液，并依次稀釋為1：100，1：500，1：1000的供試液。（2）試驗組：取1：10，1：100，1：500，1：1000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL含菌落數不大于100cfu的菌液，從試管中吸取1mL注入滅菌平皿中，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝后倒置于35 ℃恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。（3）供試品對照組：以緩沖液代替菌液，同試驗組操作。（4）菌液對照組：以緩沖液代替供試液，同試驗組操作。見表1。

2.2.2薄膜過濾法（1）供試品制備：取供試品10 g，加沖洗液100 mL，制成1：10的供試液，并稀釋為1：100供試液。（2）試驗組：取供試液加入400 mL沖洗液中，通過兩張濾膜，每張濾膜用沖洗液沖洗，最后一次向沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌液，使每最后一瓶沖洗液中含菌量不大于100cfu。濾干后取下濾膜，過濾面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置，在30～35℃培養(yǎng)2 d，以算術均值作為計數結果。具體試驗方案見表1（3）供試品對照組：以緩沖液代替菌液，同試驗組操作。（4）菌液對照組：以緩沖液代替供試液，同試驗組操作。

2.2.3大腸埃希菌檢測方法（1）試驗組：取1：10的供試液10 mL及不大于100 cfu/mL大腸埃希菌菌液各1 mL，分別加入100 mL和200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)18 h。純化培養(yǎng)若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，用接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應挑選數個疑似菌落，分別接種胰酪大豆胨瓊脂斜面，培養(yǎng)18 h，作鑒定試驗。（3）供試品對照組：以緩沖液代替菌液，同試驗組操作。（4）菌液對照組：以緩沖液代替供試液，同試驗組操作。

2.3方法驗證參考2.2.2中對敏感菌金黃色葡萄球菌的回收率實驗結果，需氧菌總數按以下條件進行方法適應性驗證：取制備好的1：100供試液2 mL，加入沖洗液400 mL中，平行通過兩張濾膜，每張濾膜用沖洗液400 mL沖洗（分4次，100 mL/次），最后一次向沖洗液中加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌，黑曲霉孢子懸液，使每最后一瓶沖洗液中含菌量不大于100cfu。濾干后取下濾膜，過濾面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置，在30～35℃培養(yǎng)2 d，以算術均值作為計數結果。霉菌和酵母菌總數按以下條件驗證：取上述制備好的1：100供試液2 mL，加入沖洗液400 mL中，平行通過兩張濾膜，每張濾膜用沖洗液300 mL沖洗（分3次，100 mL/次），最后一次向沖洗液中加入白色念珠菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液，使每最后一瓶沖洗液中含菌量不大于100cfu。濾干后取下濾膜，過濾面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置，在20 ℃～25 ℃培養(yǎng)2 d，以算術均值作為計數結果。大腸埃希菌以常規(guī)法進行驗證。

3實驗結果

3.1平皿法與稀釋法結果見表2。

3.2薄膜過濾法結果用薄膜過濾法以不同條件對敏感菌株金黃色葡萄球菌進行試驗的結果如表3所示。

3.3大腸埃希菌100 mL與20 0mL TSB的實驗結果一致，試驗組與菌液對照組為陽性，供試品對照組與陰性對照組為陰性，均可用于大腸埃希菌的檢測。

3.4方法適用性驗證結果見表4。

采用100mL對大腸埃希菌進行驗證，試驗組與菌液對照組為陽性，供試品對照組與陰性對照組為陰性。

4討論

本實驗在用薄膜過濾法進行試驗時，以敏感菌金黃色葡萄球菌摸索了很多條件，結果發(fā)現在沖洗液中加入適量的吐溫80可以提高敏感菌株的回收率，但吐溫80的含量的增加并不能顯著提高回收率，故推測適量的吐溫80對鹽酸小檗有一定助溶作用。同時，藥典中有關于溫度增加能夠提高鹽酸小檗堿的溶解度的描述[8]，文獻中也有相關報道[9]，以此為依據設計了同樣沖洗量不同溫度的試驗組，發(fā)現水浴到40℃的沖洗液可以明顯提高金黃色葡萄球菌的回收率，由于藥典對樣品前處理的規(guī)定為“均勻加熱且溫度不超過45℃”，故繼續(xù)加溫雖能提高回收率，但不建議采用40℃以上的沖洗液。除此之外，本實驗還進行了不同沖洗速度的對比，發(fā)現在沖洗的前2次使用較慢沖洗速度也可以提高菌株回收率，但實驗時間的增長會加大污染的可能性，所以是否使用這一改進措施，需按具體情況進行分析。

除了對檢測方法進行驗證外，本實驗還確定了消除鹽酸小檗堿片抑菌效果的三個關鍵因素，即沖洗液溫度，吐溫80的助溶作用和沖洗液通過濾膜的速度，希望能對之后該藥品和含鹽酸小檗堿藥物的微生物限度檢查方法開發(fā)有一定指導作用。

參考文獻：

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[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].2部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.875.

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