不同解凍方式對鰱魚肌球蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響

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(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510300)

我國淡水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá),鰱魚養(yǎng)殖成本低、生長快,資源豐富,近年來成為一種極具開發(fā)潛力的水產(chǎn)品,是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚。傳統(tǒng)的白姑魚、紅娘魚、蛇鯔魚、銅盆魚等高等級海水魚糜原料逐年減少,魚糜企業(yè)為了滿足國內(nèi)市場日益增長的需求,開始收購竹莢魚等紅肉類原料魚來摻雜生產(chǎn)魚糜,或者在高等級的魚糜原料中摻入一定比例的低劣原料魚來降低產(chǎn)品成本,因此淡水魚糜受到關(guān)注,而且在近幾年快速發(fā)展。

魚糜生產(chǎn)首先從去骨魚肉中去除血液、脂質(zhì)、肌漿蛋白和其它雜質(zhì)肌原纖維蛋白的濃縮物[1],魚糜主要由鹽溶性蛋白組成,肌球蛋白是肌原纖維蛋白中凝膠形成的關(guān)鍵組分。解凍是冷凍魚糜進(jìn)一步加工成魚糜制品前最重要的一步,是一個復(fù)雜的熱量轉(zhuǎn)移過程,會發(fā)生一系列的物理和化學(xué)變化[2]。解凍時,細(xì)胞只能吸收融化一部分水,而另一部分水會滲透到細(xì)胞外造成汁液流失,汁液流失會影響細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu),造成魚肉感官品質(zhì)的下降等,因此解凍方式的選擇至關(guān)重要。

目前有許多解凍方法,較傳統(tǒng)且應(yīng)用廣泛的兩種解凍方式是冷水解凍和空氣解凍[3],工廠生產(chǎn)效率低,解凍過程中會出現(xiàn)微生物大量繁殖、蛋白質(zhì)氧化[4-5]等現(xiàn)象,快速解凍方式是目前行業(yè)迫切需要的。為了提高生產(chǎn)效率和保證品質(zhì),微波解凍作為一種新型解凍技術(shù),將冷凍品利用微波的穿透性迅速加熱,使其內(nèi)外同步解凍并升溫至不滴水的狀態(tài)[6],因?yàn)槠浣鈨鰰r間短的優(yōu)勢備受青睞。據(jù)Karel等[7]報道,微波解凍有速度快、均勻度高且對肌肉組織損傷少等優(yōu)點(diǎn)。Taher等[8]以凍結(jié)牛肉為研究對象,通過開發(fā)微波解凍模型,發(fā)現(xiàn)微波解凍時間是常規(guī)解凍時間的1/5。田晨曦等[9]研究了不同解凍方式(自然解凍、靜水解凍、微波解凍和超聲解凍)對南美白對蝦品質(zhì)的影響也發(fā)現(xiàn)微波解凍時間較短。常海軍等[10]以豬肉為研究對象發(fā)現(xiàn)微波解凍有利于保持肉的嫩度和色澤,其肌肉全蛋白含量較高,全質(zhì)構(gòu)特性較好。Fik等[11]將面包進(jìn)行微波解凍和空氣解凍,發(fā)現(xiàn)微波解凍下的面包質(zhì)量更好。

目前,解凍方式對冷凍鰱魚肌球蛋白影響的報道較少,因此,本研究通過比較傳統(tǒng)方法(冷水解凍,cold water thawing,WT)、微波方法(微波解凍,microwave thawing,MT)、聯(lián)合方法(微波-冷水聯(lián)合解凍,microwave-cold water joint thawing,MWT)對鰱魚肌球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)(巰基含量、表面疏水性、溶解度、色氨酸熒光光譜、傅里葉紅外轉(zhuǎn)換光譜、熱穩(wěn)定性)的影響,為冷凍魚糜微波解凍品質(zhì)控制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活白鰱魚 大連熟食品交易中心;三磷酸腺苷(ATP) 化學(xué)純,美國Sigma藥品公司;溴化鉀 光譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris) 生化試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;NEXUS670型紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司;Q20差示掃描量熱儀 美國Hitachi High-tech science公司;SynergyH1/H1M酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司;F-2700熒光分光光度計 日本Hitachi公司;DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠制造;G80D23CSL-Q6格蘭仕微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司;SL-1050D4海爾商用立式四門冷凍廚房冰箱 青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 試劑A:0.1 mol/L氯化鉀以及0.02 mol/L三羥甲基氨基甲烷,攪拌溶解,0.1 mol/L鹽酸調(diào)pH至7.0后定容至1 L于4 ℃環(huán)境中備用;試劑B:0.45 mol/L氯化鈉26.298 g,0.2 mol/L醋酸鎂,0.001 mol/L EDTA,0.02 mol/L三羥基甲基氨基甲烷,0.005 mol/Lβ-疏基乙醇,攪拌溶解,用0.1 mol/L鹽酸調(diào)pH至6.8,用蒸餾水定容至1 L,放置于4 ℃環(huán)境中備用;試劑C:0.5 mol/L氯化鉀,0.02 mol/L三羥甲基氨基甲烷,0.005 mol/Lβ-疏基乙醇,攪拌溶解0.1 mol/L鹽酸調(diào)pH至7.5,蒸餾水定容至1 L,放置于4 ℃環(huán)境中備用;試劑D:0.001 mol/L KHCO3溶液;試劑E:0.5 mol/L氯化鉀,0.02 mol/L三羥甲基氨基甲烷,攪拌溶解,0.1 mol/L的鹽酸調(diào)pH至7.0后定容至1 L,放置于4 ℃環(huán)境中備用。

1.2.2 肌球蛋白的提取 根據(jù)Cao等[12]的提取方法,略作修改。將白鰱魚宰殺,去頭去內(nèi)臟,用4 ℃去離子水將其沖洗干凈,手工剔取白鰱魚白肉,切成肉糜狀,加入10倍體積的溶液A于4 ℃下漂洗10 min,3000 r/min均質(zhì)后,在3000 r/min下離心5 min,取沉淀;沉淀于5倍體積溶液B中懸浮,并加ATP至終濃度為0.005 mol/L,于4 ℃下放置2 h;8000 r/min離心20 min,上清液加入3倍體積溶液D于4 ℃下放置15 min;9000 r/min離心15 min取沉淀;沉淀加入2.5倍體積的溶液C懸浮,于4 ℃下放置10 min后加入2.5倍體積的溶液D稀釋,并加MgCl2至終濃度為0.01 mol/L,于4 ℃下放置過夜;10000 r/min離心15 min,沉淀用1倍體積溶液E溶解,5000 r/min離心10 min,取上清,透析一夜,2 h更換一次去離子水,所得即為肌球蛋白。

1.2.2 肌球蛋白濃度的測定 采用雙縮脲法[13],使用SynergyH1/H1M酶標(biāo)儀在540 nm下測定吸光值,以BSA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪圖。準(zhǔn)確吸取1 mL提取的鰱魚肌球蛋白溶液,加入4 mL雙縮脲試劑并混合均勻,將所有樣品避光靜置30 min,測量其在540 nm處的吸光值,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的肌球蛋白濃度。

1.2.3 肌球蛋白的不同解凍處理 分裝稀釋成5 mg/mL的樣品于自封袋內(nèi)進(jìn)行密封。將樣品凍結(jié)在(-20±1) ℃條件下,24 h后進(jìn)行解凍。冷水解凍:樣品放入盛有水的燒杯中,遠(yuǎn)離熱源解凍,水溫(18±2) ℃,中心溫度達(dá)4 ℃后解凍完成;微波解凍:微波輸出功率為800 W,頻率為2450 MHz,設(shè)備按質(zhì)量設(shè)置解凍時間,中心溫度達(dá)4 ℃后解凍完成;微波-冷水聯(lián)合解凍:樣品浸入盛有水的容器中,再微波解凍。樣品解凍后進(jìn)行巰基含量、表面疏水性、溶解度、色氨酸熒光光譜、傅里葉紅外轉(zhuǎn)換光譜及熱穩(wěn)定性的測定。

1.2.4 巰基含量 根據(jù)Ellman等[14]的研究方法,略作修改。吸取0.5 mL 1 mg/mL肌球蛋白溶液加入2 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.08 mmol/L尿素,2% SDS,10 mmol/L EDTA,pH7.5),再加入100 μL DTNB(10 mmol/L DTNB,pH7.2),混勻后40 ℃水浴25 min。空白為0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液,使用SynergyH1/H1M酶標(biāo)儀在412 nm下測定吸光值。按下列公式計算巰基含量:

其中:A412為肌球蛋白溶液吸光值-空白對照組吸光值;C為分子吸光系數(shù),值為13600 M/cm。

1.2.5 表面疏水性 根據(jù)Benjakus等[15]的研究方法,略作修改。將鰱魚肌球蛋白用含0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液稀釋成0.1～0.5 mg/mL的系列濃度,然后取各濃度蛋白溶液2 mL加入10 μL ANS(10 mmol/L ANS,20 mmol/L Tris-HCl,pH7.5),混勻避光靜置10 min。使用SynergyH1/H1M酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù):激發(fā)波長303 nm,發(fā)射波長485 nm,增益50。以熒光強(qiáng)度對鰱魚肌球蛋白各濃度作圖,所得直線斜率即為肌球蛋白表面疏水性系數(shù)。

1.2.6 溶解度 根據(jù)周建中等[16]的研究方法,略作修改。將鰱魚肌球蛋白用含0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液稀釋成3 mg/mL,4 ℃下靜置30 min,之后4 ℃下10000 r/min離心10 min,收集上清液,采用雙縮脲法測上清蛋白含量。按下列公式計算溶解度:

1.2.7 色氨酸熒光光譜 根據(jù)Li等[17]的研究方法,略作修改。將肌球蛋白樣品用含0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液稀釋成1 mg/mL。使用Hitachi熒光分光光度計進(jìn)行測定,設(shè)定激發(fā)光的起始波長300 nm,熒光發(fā)射波長280 nm,激發(fā)光的終止波長450 nm,該條件下熒光強(qiáng)度值為熒光圖譜中的峰值。

1.2.8 傅里葉紅外轉(zhuǎn)換光譜(FT-IR) 根據(jù)Liu[18]的研究方法,略作修改。樣品冷凍干燥后用瑪瑙研缽研成粉末,取2 mg肌球蛋白粉末與烘干后的無水溴化鉀100 mg充分混合,在約15 MPa的壓力下加壓2 min形成溴化鉀壓片,光譜觀察范圍為450～4000 cm-1。

1.2.9 熱穩(wěn)定性分析(DSC) 根據(jù)Dergez[19]的研究方法,略作修改。準(zhǔn)確稱量(10±2) mg樣品置于鋁盤中并立即密封。以空盤作為空白,掃描溫度為0～150 ℃,升溫速率為5 ℃/min。通過掃描出的峰值確定變性溫度(Td, ℃)和計算峰面積得到熱焓值(ΔH,J·g-1)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù),指標(biāo)測定為3次平行測定結(jié)果。采用Microsoft Excel 2010軟件繪圖,利用IBM SPSS Statistics 21.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行Duncan法多重比較及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌球蛋白濃度

獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=0.025x-0.0006(R2=0.9999)其中:Y為吸光度的平均值,X為肌球蛋白濃度。經(jīng)過計算所提取出的肌球蛋白濃度為25.84 mg/mL。

圖1 肌球蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of myosin content

2.2 解凍方式對肌球蛋白巰基含量的影響

巰基對發(fā)揮蛋白質(zhì)的功能特性有很大的作用,解凍后冰晶融化重新被吸收的過程中肌原纖維蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化,導(dǎo)致巰基暴露,進(jìn)而被氧化成二硫鍵,導(dǎo)致巰基含量降低[20-21]。從圖2中可以看出,不同解凍方式下巰基含量無顯著性差異(P>0.05),但MT方式下的肌球蛋白巰基含量相對較高,為23.74 nmol/mg,意味著與其它兩種方式處理下的肌球蛋白相比二硫鍵更少,說明肌球蛋白構(gòu)象變化相對較小,氧化程度低于其它兩種解凍方式,可能是解凍過程中MT方式下解凍時間相對較短,巰基氧化成二硫鍵數(shù)量少,而MWT方式下由于需要加熱水進(jìn)而解凍肌球蛋白因而時間較長,冰晶融化后重新被吸收的過程中肌球蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,巰基氧化成二硫鍵?；潞Ｕ涞萚22]通過探究微波解凍對凍結(jié)秘魯魷魚蛋白質(zhì)氧化程度的影響發(fā)現(xiàn)低功率的微波解凍可降低秘魯魷魚肌肉的蛋白質(zhì)氧化程度,巰基含量隨著微波功率的增加逐漸降低。同時Kim[23]也發(fā)現(xiàn)微波解凍可以降低蛋白質(zhì)的變性程度,與研究結(jié)果一致,微波解凍對肌球蛋白影響較小,蛋白質(zhì)氧化程度低。

圖2 不同解凍方式下鰱魚肌球蛋白巰基含量Fig.2 Changes in sulfhydryl content of thesilver carp myosin at different thawing methods注:不同小寫字母表示不同解凍方式處理下差異顯著(P<0.05)。

2.3 解凍方式對肌球蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的變性程度和分子結(jié)構(gòu)的變化可以通過外源疏水探針結(jié)合的蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸相對含量來衡量,即蛋白質(zhì)分子的展開及非極性氨基酸的暴露情況[24-25]。表面疏水性越高,蛋白質(zhì)變性程度越大[26]。從圖3中可以看出,MT方式下的表面疏水性的相對含量為530,與WT方式下的有顯著性差異(P<0.05),MT方式下的肌球蛋白較WT方式下表面疏水性顯著下降,說明肌球蛋白在WT方式下氧化導(dǎo)致肌球蛋白蛋白結(jié)構(gòu)展開,聚集嚴(yán)重,暴露出的疏水性氨基酸殘基更多使得蛋白表面疏水性增強(qiáng),此時肌球蛋白球狀構(gòu)象變化較大,而MT方式下變性程度最小,肌球蛋白構(gòu)象保持最好,與巰基含量結(jié)果一致。MWT方式下的表面疏水性的相對含量與WT和MT方式下的均為無顯著性差異(P>0.05)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明微波解凍可降低蛋白質(zhì)的變性程度。

圖3 不同解凍方式下鰱魚肌球蛋白表面疏水性Fig.3 Changes in surface hydrophobicity ofthe silver carp myosin at different thawing methods注:不同小寫字母表示不同解凍方式處理下差異顯著(P<0.05)。

2.4 解凍方式對肌球蛋白溶解度的影響

蛋白質(zhì)溶解度的大小在實(shí)際應(yīng)用中非常重要。從圖4中可以看出三種解凍方式處理下的鰱魚肌球蛋白溶解度無顯著性差異(P>0.05),溶解度越低說明蛋白聚集程度高,伴隨嚴(yán)重的變性現(xiàn)象。解凍后溶解度WT方式下最高,為79.68%,其次是MT方式,MWT方式下最低,與巰基含量和表面疏水性的結(jié)果不一致,可能是WT方式下氧化雖然使巰基基團(tuán)氧化成二硫鍵,但肌球蛋白聚集程度不大,未對溶解度造成很大影響。

圖4 不同解凍方式下鰱魚肌球溶解度Fig.4 Changes in solubility of the silver carpmyosin at different thawing methods注:不同小寫字母表示不同解凍方式處理下差異顯著(P<0.05)。

2.5 解凍方式對肌球蛋白色氨酸熒光強(qiáng)度的影響

色氨酸內(nèi)源熒光對環(huán)境非常敏感,因此可用來檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象和微環(huán)境的極性變化[27]。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化可以通過色氨酸殘基的暴露程度反映。從圖5中可以看出,不同解凍方式對色氨酸熒光光譜形狀影響不顯著,即肌球蛋白構(gòu)象變化不明顯,但對熒光強(qiáng)度影響顯著,熒光強(qiáng)度下降的趨勢為:WT≥MWT>MT,WT與MWT熒光強(qiáng)度基本一致,解凍過程中色氨酸的微環(huán)境發(fā)生變化,蛋白展開變性使得埋藏在肌球蛋白分子內(nèi)部色氨酸的吲哚基團(tuán)暴露在表面,說明MT方式下肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)展開嚴(yán)重,肌球蛋白的天然排列方式較其它方式破壞嚴(yán)重,色氨酸殘基暴露多。研究發(fā)現(xiàn)隨著加熱溫度的升高,內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸降低[28],因此,分析原因可能是MT方式解凍過程中受熱引起肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)展開,進(jìn)一步研究及中試試驗(yàn)過程中應(yīng)尋求精準(zhǔn)控溫的微波解凍設(shè)備。

圖5 不同解凍方式下鰱魚肌球蛋白色氨酸熒光強(qiáng)度Fig.5 Changes in fluorescence spectra ofthe silver carp myosin at different thawing methods

2.6 解凍方式對肌球蛋白傅里葉紅外轉(zhuǎn)換光譜的影響

傅里葉紅外轉(zhuǎn)換光譜能夠用來表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),尤其在測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用,利用與分子中有振動模式的化學(xué)鍵能夠研究分子的結(jié)構(gòu)從而得到與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息。酰胺I帶(1600～1700 cm-1)的紅外吸收峰主要由C=O的伸縮振動引起的,用此來研究其二級結(jié)構(gòu)的變化,其中1600～1639 cm-1被認(rèn)為是β-折疊波段[29],從圖6中可以看出在1600 cm-1處有一個大的吸收峰,這是蛋白質(zhì)的β-折疊區(qū)域。對比三種不同解凍方式,MWT方式下的β-折疊含量最低,說明紅外吸收強(qiáng),肌球蛋白變性程度高于MT方式和WT方式,MT方式下β-折疊含量最高,肌球蛋白變性程度最低,MWT方式下的紅外吸收最強(qiáng),肌球蛋白變性程度最大。

圖6 不同解凍方式下鰱魚肌球蛋白FT-IR圖Fig.6 Changes in FT-IR spectra of thesilver carp myosin at different thawing methods注:(a)MT;(b)WT;(c)MWT。

2.7 解凍方式對肌球蛋白熱穩(wěn)定性的影響

DSC可直接表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,曲線中有吸收峰出現(xiàn)表明蛋白變性有熱量被吸收。熱焓值的大小反映蛋白質(zhì)的變性程度,變性溫度、熱焓值與蛋白質(zhì)變性程度呈負(fù)相關(guān),轉(zhuǎn)變溫度與變性焓越高,蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越高、變性程度越小[30]。從表1中可以看出,轉(zhuǎn)變溫度為MWT>MT>WT,說明肌球蛋白的最大吸熱轉(zhuǎn)變溫度受解凍方式的影響。解凍后的肌球蛋白變性轉(zhuǎn)變溫度均高于45 ℃,與其它研究結(jié)果不一致,Ogawa等[31]利用DSC研究了10種魚類的肌球蛋白變性轉(zhuǎn)變溫度發(fā)現(xiàn)各種魚的肌球蛋白最大吸熱轉(zhuǎn)變發(fā)生在45 ℃左右,分析原因可能是進(jìn)行測試的肌球蛋白樣品濃度過低,為5 mg/mL。WT方式下肌球蛋白變性的轉(zhuǎn)變溫度最低,而MWT方式下的肌球蛋白轉(zhuǎn)變溫度最高,說明WT方式下肌球蛋白熱穩(wěn)定性低,變性越大,抗變性能力越弱,MT方式下肌球蛋白熱穩(wěn)定性相對較好。在不同解凍方式處理下的肌球蛋白發(fā)生復(fù)雜變化,三種解凍方式下的肌球蛋白熱力學(xué)特性差異較大。

表1 不同解凍方式對肌球蛋白熱穩(wěn)定性的影響Table 1 Changes in the thermal stability of thesilver carp myosin at different thawing methods

3 結(jié)論

不同的解凍方式對鰱魚肌球蛋白解凍后的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有不同的影響。就巰基含量、表面疏水性和傅里葉紅外轉(zhuǎn)換光譜和熱穩(wěn)定性變化指標(biāo)看,微波解凍較優(yōu)于其它兩種方式;就溶解度、色氨酸熒光強(qiáng)度變化而言,冷水解凍優(yōu)于其它兩種方式。三種解凍方式中微波解凍對鰱魚肌球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響相對較小,比較適合鰱魚的解凍。未考察微波解凍功率和解凍時間對肌球蛋白解凍的影響,需進(jìn)一步從分子層面研究解凍方式對鰱魚肌球蛋白的作用機(jī)制,并考察肌球蛋白氧化的影響。