米諾環(huán)素對(duì)黑質(zhì)急性炎癥的保護(hù)作用及與自噬相關(guān)性研究

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因尚未完全明確，研究表明，免疫/炎癥機(jī)制參與了PD的發(fā)病[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要的免疫/炎癥細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，是PD等神經(jīng)退行性疾病的共同病理生理機(jī)制。黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量是腦內(nèi)其他部位的4.5倍，因此該部位對(duì)炎癥刺激更為敏感，一旦小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活呈慢性、持續(xù)性狀態(tài)，就會(huì)分泌出大量的促炎因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-β(IL-β)、一氧化氮(NO)等，最終導(dǎo)致該部位多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞嚴(yán)重受損甚至死亡[1]。受傷的神經(jīng)元細(xì)胞同時(shí)還生成一些物質(zhì)，如α-突觸核蛋白(α-synuclein)[2]，其病理性蓄積的發(fā)生早于多巴胺神經(jīng)元的死亡，而細(xì)胞自噬功能障礙是導(dǎo)致α-synuclein清除障礙和異常積聚的重要因素[3-4]。隨著對(duì)自噬應(yīng)激認(rèn)識(shí)的深入，日益認(rèn)識(shí)到單純的自噬激活并不能對(duì)α-synuclein 病理性蓄積引起的多巴胺能神經(jīng)元死亡發(fā)揮保護(hù)作用，若自噬誘導(dǎo)與自噬降解之間失平衡反而可能會(huì)加劇神經(jīng)元損傷。

四環(huán)素類(lèi)抗生素是一類(lèi)廣譜堿性抗生素，其半合成有多西環(huán)素和米諾環(huán)素(minocyclein)等。早已有研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素能通過(guò)血腦屏障，在腦脊液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有很高的血藥濃度，且具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。目前對(duì)米諾環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)研究主要集中在神經(jīng)炎癥的調(diào)控和神經(jīng)元凋亡這兩方面[6]，有關(guān)α-synuclein降解和自噬/溶酶體方面尚無(wú)深入研究。動(dòng)物模型研究證實(shí)，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)單次腹腔注射能引起黑質(zhì)部位急性炎癥反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)活化，出現(xiàn)慢性、進(jìn)行性加重PD樣的病理改變[7]。本研究利用這一PD模型，就米諾環(huán)素對(duì)黑質(zhì)急性炎癥、α-synuclein降解和自噬功能障礙的影響進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL 3月齡雄性小鼠，體質(zhì)量250～280 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003]。小鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)[SYXK(蘇)2005-0001]。飼養(yǎng)密度4只/盒，溫度(24±1) ℃，相對(duì)濕度(70±4)%，自由攝食與飲水，自動(dòng)光控12 h明暗周期。

1.2 藥品與試劑 LPS、米諾環(huán)素、兔抗α-synuclein抗體購(gòu)自Sigma 公司；羊抗Iba-1抗體、兔抗LC3抗體購(gòu)自Abcam 公司；兔抗HDAC6抗體購(gòu)自Bioworld 公司；兔抗p62抗體購(gòu)自ZNEO公司；小鼠單克隆β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；Western及IP細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；普通二抗購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物的分組和給藥 所有小鼠被隨機(jī)分為7組：(1)對(duì)照組；(2)單獨(dú)LPS組；(3)75 mg M+LPS組；(4)50 mg M+LPS組；(5)25 mg M+LPS組；(6)單獨(dú)75 mg M組；(7)單獨(dú) 50 mg M組(75 mg M、50 mg M、25 mg M分別代表75 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg米諾環(huán)素)。單獨(dú)或聯(lián)合使用米諾環(huán)素干預(yù)的組別按對(duì)應(yīng)的米諾環(huán)素劑量連續(xù)給藥3次，分別為L(zhǎng)PS注射前2 d、1 d和1 h；對(duì)照組和單獨(dú)LPS組給予50 mg/kg生理鹽水注射。所有LPS處理組小鼠單次腹腔注射LPS 5 mg/kg，對(duì)照組和單獨(dú)米諾環(huán)素組小鼠給予同等劑量的生理鹽水。

1.4 行為學(xué)測(cè)試 分別在LPS注射前1 d、注射后1 d對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。每次測(cè)試的順序是隨機(jī)的，檢測(cè)時(shí)間均選在開(kāi)始光照后的2 h。所有行為學(xué)檢測(cè)均在一恒溫、固定布局、安靜并光照充分的房間進(jìn)行，固定由2名實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行，一人負(fù)責(zé)儀器操作，另一人負(fù)責(zé)記錄。

爬桿試驗(yàn)：爬桿時(shí)間是反映小鼠運(yùn)動(dòng)功能的良好行為學(xué)指標(biāo)，能綜合評(píng)價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力。自制小鼠爬桿，為一根豎直圓桿，直徑8 mm，高度70 cm，表面纏敷醫(yī)用膠布以防滑，并標(biāo)有刻度。測(cè)試前引導(dǎo)、訓(xùn)練小鼠從桿頂向下爬至桿底平面2次，測(cè)試時(shí)將小鼠頭端向下置于桿頂，記錄小鼠從50 cm高度爬至桿底平面的時(shí)間作為小鼠爬桿所需時(shí)間，每只小鼠測(cè)3次，每次間隔5 min。小鼠中途如出現(xiàn)調(diào)頭、停滯不前或直接躍下均視為無(wú)效結(jié)果，需重新測(cè)試。

1.5 免疫組化法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞變化 脫頸法迅速斷頭取腦，并切取黑質(zhì)相應(yīng)區(qū)域(Bregma-2.8至Bregma-3.8)組織，以SP法行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，滴加所需的一抗(Iba-1為1：100)，空白對(duì)照組用磷酸鹽緩沖液代替一抗，置4℃冰箱過(guò)夜后滴加二抗，DAB顯色劑顯色，適時(shí)終止顯色反應(yīng)，封固。光鏡下計(jì)數(shù)所有包含黑質(zhì)區(qū)域的切片中Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，累計(jì)每例所有切片計(jì)數(shù)之和，并觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.6 免疫印跡法測(cè)定自噬相關(guān)蛋白含量 脫頸法迅速斷頭取腦,并切取黑質(zhì)相應(yīng)區(qū)域(Bregma-2.8至Bregma -3.8)組織存于-80 ℃冰箱，選取腹側(cè)中腦相應(yīng)黑質(zhì)部位的組織，按10 mg/mL加入裂解液制成勻漿，冰浴靜置30 min，離心取上清總蛋白質(zhì)，以磷酸緩沖鹽溶液將各樣品蛋白稀釋至相同濃度后，采用免疫印跡法(Western blot法)測(cè)定α-synuclein和自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、p62和HDAC6蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果 LPS注射后1 d與對(duì)照組相比，LPS處理組小鼠爬桿速度減慢(P<0.01)；其中，與單獨(dú)LPS組相比，75 mg M+LPS組小鼠爬桿速度進(jìn)一步減慢(P<0.05)，而25 mg M+LPS組及50 mg M+LPS組爬桿速度較LPS組則顯著提高(P<0.01)；與此同時(shí)，單獨(dú)米諾環(huán)素組(包括75 mg M組和50 mg M組)爬桿速度較對(duì)照組無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與單獨(dú)LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01圖1 小鼠爬桿速度變化(n=10)

2.2 LPS注射后1 d各組小鼠黑質(zhì)部位炎癥反應(yīng)變化 與對(duì)照組相比，LPS處理組小鼠黑質(zhì)部位出現(xiàn)大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，單獨(dú)米諾環(huán)素(包括75 mg M和50 mg M)組小鼠黑質(zhì)部位也出現(xiàn)極少量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。與LPS組相比，25 mg M+LPS組和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均有所減少，而75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有所增加。見(jiàn)圖2。

2.3 黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平變化 與對(duì)照組相比，LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平顯著增加(P<0.01)，25 mg M+LPS組和50 mg M+LPS組無(wú)明顯變化(P>0.05)；75 mg M及50 mg M組小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平與對(duì)照組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LPS組相比，75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平顯著增加(P<0.05)，而25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平則較LPS組明顯下降(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

2.4 黑質(zhì)部位自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4.1 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平變化：與對(duì)照組相比，LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著提高，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平也提高(P<0.001)，75 mg M組小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白水平也出現(xiàn)少量增加(P<0.05)，50 mg M組無(wú)明顯變化(P>0.05)。與LPS組相比，75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加(P<0.05)，而25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白水平顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖2 小鼠黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1)，30 μm

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01圖3 小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白表達(dá)變化(n=4)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01圖4 小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)變化(n=4)

2.4.2 p62蛋白表達(dá)水平變化：與對(duì)照組相比，LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位p62蛋白水平顯著增加(P<0.001)，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠無(wú)明顯變化(P>0.05)；與LPS組相比，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位p62蛋白水平明顯下降(P<0.001)。見(jiàn)圖5。

2.4.3 HDAC6蛋白表達(dá)水平變化：與對(duì)照組相比，LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位HDAC6蛋白水平顯著增加(P<0.001)，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠輕度增加(P<0.01)；與LPS組相比，25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位HDAC6蛋白水平明顯下降(P<0.001)。見(jiàn)圖6。

3 結(jié)論

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001；與LPS組比較， ###P<0.001圖5 小鼠黑質(zhì)部位p62蛋白表達(dá)變化(n=4)

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與LPS組比較，###P<0.001圖6 小鼠黑質(zhì)部位HDAC6蛋白表達(dá)變化(n=4)

目前PD的病因尚不明確，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死和α-synuclein的異常積聚是PD的主要病理特征。神經(jīng)炎癥是所有神經(jīng)退行性疾病的共同病理機(jī)制，受損神經(jīng)元和炎癥反應(yīng)之間存在著自我推進(jìn)式的惡性循環(huán)，任何能打破該惡性循環(huán)的治療都應(yīng)該可以延緩該類(lèi)神經(jīng)疾病的進(jìn)展?；?qū)W分析提示，許多炎癥因子的DNA多態(tài)性是PD的危險(xiǎn)因素[8]；抗炎藥物能降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，減少促炎癥因子的分泌，各國(guó)學(xué)者紛紛致力于尋找合適的藥物調(diào)控促炎因子的生成，從而在神經(jīng)退行性疾病的治療中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5,7]。

本研究表明，25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素干預(yù)能明顯改善PD模型小鼠的急性運(yùn)動(dòng)障礙，減輕黑質(zhì)部位的急性炎癥反應(yīng)，在一定程度上打破黑質(zhì)部位受損多巴胺神經(jīng)元和炎癥反應(yīng)之間自我推進(jìn)式的惡性循環(huán)，有可能延緩多巴胺神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失。PD的發(fā)病與多種機(jī)制有關(guān)，其中α-synuclein清除受損和自噬功能障礙是其中重要的一環(huán)。分泌至胞外的α-synuclein不僅會(huì)造成周?chē)窠?jīng)元的損傷[9]，還可以激活周?chē)z質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生[10]。因此，能夠激活自噬的藥物可通過(guò)促進(jìn)α-synuclein清除來(lái)延緩疾病進(jìn)展[11]。本研究在證實(shí)了米諾環(huán)素的抗炎癥作用同時(shí)，研究了小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平變化，發(fā)現(xiàn)25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素的預(yù)處理亦能緩解PD小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein的異常聚集。因此，筆者有理由推測(cè)米諾環(huán)素可能通過(guò)減少α-synuclein的積聚而延緩PD的進(jìn)程。

細(xì)胞自噬普遍存在于真核細(xì)胞中，是細(xì)胞通過(guò)自身形成的囊泡，吞噬胞漿內(nèi)變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過(guò)程[12]。在病理狀態(tài)或老化狀態(tài)下，將出現(xiàn)自噬激活和降解兩者間的失衡，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白在體內(nèi)的積聚，細(xì)胞自噬功能障礙參與了PD的發(fā)生。研究表明，四環(huán)素類(lèi)抗生素米諾環(huán)素和替加環(huán)素具有誘導(dǎo)自噬的功能[13-14]，米諾環(huán)素可以通過(guò)AMPKα1信號(hào)介導(dǎo)的自噬抑制輻射誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[15]。有研究者在PD病人的大腦黑質(zhì)中檢測(cè)到了空泡樣的自噬體，并且觀察到了LC3-Ⅱ的表達(dá)上調(diào)[16]。自噬的激活可能是有利于神經(jīng)元存活的保護(hù)性反應(yīng)，但是過(guò)度激活將導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[17-18]。自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、HDAC6和p62三者與自噬的發(fā)生密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素干預(yù)組PD小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ、HDAC6蛋白表達(dá)下降，自噬底物p62蛋白的表達(dá)量也出現(xiàn)同步下降，結(jié)合上述對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠相同部位α-synuclein蛋白表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果分析，可以合理推測(cè)PD模型小鼠黑質(zhì)部位的自噬應(yīng)激在25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素預(yù)干預(yù)下有所緩解，自噬激活和降解間的失衡有所好轉(zhuǎn)。

本研究結(jié)果顯示，75 mg M+LPS米諾環(huán)素干預(yù)組中LC3-Ⅱ、HDAC6的蛋白表達(dá)量較單獨(dú)LPS組進(jìn)一步增加，而且自噬產(chǎn)物p62和α-synuclein的水平也出現(xiàn)同步增加。與此同時(shí)，單獨(dú)75 mg/kg米諾環(huán)素組實(shí)驗(yàn)小鼠黑質(zhì)部位的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組也有所增加，這一結(jié)果提示，高劑量的米諾環(huán)素可能存在某種機(jī)制導(dǎo)致自噬的過(guò)度激活，需要在后期的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)觀察及深入研究。另一方面也提示，單純激活自噬很可能是無(wú)效的，甚至是有害的，維持自噬激活和底物降解之間的平衡，促進(jìn)底物的降解可能具有更好的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，低、中劑量的米諾環(huán)素可保護(hù)LPS所致的小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷，減輕系統(tǒng)性炎癥所致黑質(zhì)部位的急性炎癥反應(yīng)，平衡過(guò)度激活的自噬功能，促進(jìn)α-synuclein自噬性清除可能是其有效的作用機(jī)制。因此，米諾環(huán)素是PD治療的一個(gè)非常有潛力的靶點(diǎn)藥物，其在臨床應(yīng)用中的可行性、有效性和安全性等問(wèn)題則需要更多及更深入的研究。