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    米諾環(huán)素對(duì)黑質(zhì)急性炎癥的保護(hù)作用及與自噬相關(guān)性研究

    2019-11-27 03:15:42
    實(shí)用老年醫(yī)學(xué) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:黑質(zhì)米諾環(huán)素

    帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其病因尚未完全明確,研究表明,免疫/炎癥機(jī)制參與了PD的發(fā)病[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要的免疫/炎癥細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,是PD等神經(jīng)退行性疾病的共同病理生理機(jī)制。黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量是腦內(nèi)其他部位的4.5倍,因此該部位對(duì)炎癥刺激更為敏感,一旦小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活呈慢性、持續(xù)性狀態(tài),就會(huì)分泌出大量的促炎因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-β(IL-β)、一氧化氮(NO)等,最終導(dǎo)致該部位多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞嚴(yán)重受損甚至死亡[1]。受傷的神經(jīng)元細(xì)胞同時(shí)還生成一些物質(zhì),如α-突觸核蛋白(α-synuclein)[2],其病理性蓄積的發(fā)生早于多巴胺神經(jīng)元的死亡,而細(xì)胞自噬功能障礙是導(dǎo)致α-synuclein清除障礙和異常積聚的重要因素[3-4]。隨著對(duì)自噬應(yīng)激認(rèn)識(shí)的深入,日益認(rèn)識(shí)到單純的自噬激活并不能對(duì)α-synuclein 病理性蓄積引起的多巴胺能神經(jīng)元死亡發(fā)揮保護(hù)作用,若自噬誘導(dǎo)與自噬降解之間失平衡反而可能會(huì)加劇神經(jīng)元損傷。

    四環(huán)素類(lèi)抗生素是一類(lèi)廣譜堿性抗生素,其半合成有多西環(huán)素和米諾環(huán)素(minocyclein)等。早已有研究發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素能通過(guò)血腦屏障,在腦脊液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有很高的血藥濃度,且具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。目前對(duì)米諾環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)研究主要集中在神經(jīng)炎癥的調(diào)控和神經(jīng)元凋亡這兩方面[6],有關(guān)α-synuclein降解和自噬/溶酶體方面尚無(wú)深入研究。動(dòng)物模型研究證實(shí),脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)單次腹腔注射能引起黑質(zhì)部位急性炎癥反應(yīng),小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)活化,出現(xiàn)慢性、進(jìn)行性加重PD樣的病理改變[7]。本研究利用這一PD模型,就米諾環(huán)素對(duì)黑質(zhì)急性炎癥、α-synuclein降解和自噬功能障礙的影響進(jìn)行初步探討。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL 3月齡雄性小鼠,體質(zhì)量250~280 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[許可證號(hào):SCXK(滬)2003-0003]。小鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)[SYXK(蘇)2005-0001]。飼養(yǎng)密度4只/盒,溫度(24±1) ℃,相對(duì)濕度(70±4)%,自由攝食與飲水,自動(dòng)光控12 h明暗周期。

    1.2 藥品與試劑 LPS、米諾環(huán)素、兔抗α-synuclein抗體購(gòu)自Sigma 公司;羊抗Iba-1抗體、兔抗LC3抗體購(gòu)自Abcam 公司;兔抗HDAC6抗體購(gòu)自Bioworld 公司;兔抗p62抗體購(gòu)自ZNEO公司;小鼠單克隆β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;Western及IP細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;普通二抗購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.3 動(dòng)物的分組和給藥 所有小鼠被隨機(jī)分為7組:(1)對(duì)照組;(2)單獨(dú)LPS組;(3)75 mg M+LPS組;(4)50 mg M+LPS組;(5)25 mg M+LPS組;(6)單獨(dú)75 mg M組;(7)單獨(dú) 50 mg M組(75 mg M、50 mg M、25 mg M分別代表75 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg米諾環(huán)素)。單獨(dú)或聯(lián)合使用米諾環(huán)素干預(yù)的組別按對(duì)應(yīng)的米諾環(huán)素劑量連續(xù)給藥3次,分別為L(zhǎng)PS注射前2 d、1 d和1 h;對(duì)照組和單獨(dú)LPS組給予50 mg/kg生理鹽水注射。所有LPS處理組小鼠單次腹腔注射LPS 5 mg/kg,對(duì)照組和單獨(dú)米諾環(huán)素組小鼠給予同等劑量的生理鹽水。

    1.4 行為學(xué)測(cè)試 分別在LPS注射前1 d、注射后1 d對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。每次測(cè)試的順序是隨機(jī)的,檢測(cè)時(shí)間均選在開(kāi)始光照后的2 h。所有行為學(xué)檢測(cè)均在一恒溫、固定布局、安靜并光照充分的房間進(jìn)行,固定由2名實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行,一人負(fù)責(zé)儀器操作,另一人負(fù)責(zé)記錄。

    爬桿試驗(yàn):爬桿時(shí)間是反映小鼠運(yùn)動(dòng)功能的良好行為學(xué)指標(biāo),能綜合評(píng)價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力。自制小鼠爬桿,為一根豎直圓桿,直徑8 mm,高度70 cm,表面纏敷醫(yī)用膠布以防滑,并標(biāo)有刻度。測(cè)試前引導(dǎo)、訓(xùn)練小鼠從桿頂向下爬至桿底平面2次,測(cè)試時(shí)將小鼠頭端向下置于桿頂,記錄小鼠從50 cm高度爬至桿底平面的時(shí)間作為小鼠爬桿所需時(shí)間,每只小鼠測(cè)3次,每次間隔5 min。小鼠中途如出現(xiàn)調(diào)頭、停滯不前或直接躍下均視為無(wú)效結(jié)果,需重新測(cè)試。

    1.5 免疫組化法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞變化 脫頸法迅速斷頭取腦,并切取黑質(zhì)相應(yīng)區(qū)域(Bregma-2.8至Bregma-3.8)組織,以SP法行免疫組織化學(xué)檢測(cè),滴加所需的一抗(Iba-1為1:100),空白對(duì)照組用磷酸鹽緩沖液代替一抗,置4℃冰箱過(guò)夜后滴加二抗,DAB顯色劑顯色,適時(shí)終止顯色反應(yīng),封固。光鏡下計(jì)數(shù)所有包含黑質(zhì)區(qū)域的切片中Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù),累計(jì)每例所有切片計(jì)數(shù)之和,并觀察形態(tài)學(xué)變化。

    1.6 免疫印跡法測(cè)定自噬相關(guān)蛋白含量 脫頸法迅速斷頭取腦,并切取黑質(zhì)相應(yīng)區(qū)域(Bregma-2.8至Bregma -3.8)組織存于-80 ℃冰箱,選取腹側(cè)中腦相應(yīng)黑質(zhì)部位的組織,按10 mg/mL加入裂解液制成勻漿,冰浴靜置30 min,離心取上清總蛋白質(zhì),以磷酸緩沖鹽溶液將各樣品蛋白稀釋至相同濃度后,采用免疫印跡法(Western blot法)測(cè)定α-synuclein和自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、p62和HDAC6蛋白表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1 行為學(xué)結(jié)果 LPS注射后1 d與對(duì)照組相比,LPS處理組小鼠爬桿速度減慢(P<0.01);其中,與單獨(dú)LPS組相比,75 mg M+LPS組小鼠爬桿速度進(jìn)一步減慢(P<0.05),而25 mg M+LPS組及50 mg M+LPS組爬桿速度較LPS組則顯著提高(P<0.01);與此同時(shí),單獨(dú)米諾環(huán)素組(包括75 mg M組和50 mg M組)爬桿速度較對(duì)照組無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與單獨(dú)LPS組比較,#P<0.05,##P<0.01圖1 小鼠爬桿速度變化(n=10)

    2.2 LPS注射后1 d各組小鼠黑質(zhì)部位炎癥反應(yīng)變化 與對(duì)照組相比,LPS處理組小鼠黑質(zhì)部位出現(xiàn)大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞,單獨(dú)米諾環(huán)素(包括75 mg M和50 mg M)組小鼠黑質(zhì)部位也出現(xiàn)極少量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。與LPS組相比,25 mg M+LPS組和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均有所減少,而75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有所增加。見(jiàn)圖2。

    2.3 黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平變化 與對(duì)照組相比,LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平顯著增加(P<0.01),25 mg M+LPS組和50 mg M+LPS組無(wú)明顯變化(P>0.05);75 mg M及50 mg M組小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平與對(duì)照組相比,差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LPS組相比,75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平顯著增加(P<0.05),而25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平則較LPS組明顯下降(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

    2.4 黑質(zhì)部位自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

    2.4.1 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平變化:與對(duì)照組相比,LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著提高,25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平也提高(P<0.001),75 mg M組小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白水平也出現(xiàn)少量增加(P<0.05),50 mg M組無(wú)明顯變化(P>0.05)。與LPS組相比,75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加(P<0.05),而25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白水平顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

    圖2 小鼠黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1),30 μm

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與LPS組比較,#P<0.05,##P<0.01圖3 小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白表達(dá)變化(n=4)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,***P<0.001;與LPS組比較,#P<0.05,##P<0.01圖4 小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)變化(n=4)

    2.4.2 p62蛋白表達(dá)水平變化:與對(duì)照組相比,LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位p62蛋白水平顯著增加(P<0.001),25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠無(wú)明顯變化(P>0.05);與LPS組相比,25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位p62蛋白水平明顯下降(P<0.001)。見(jiàn)圖5。

    2.4.3 HDAC6蛋白表達(dá)水平變化:與對(duì)照組相比,LPS組和75 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位HDAC6蛋白水平顯著增加(P<0.001),25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠輕度增加(P<0.01);與LPS組相比,25 mg M+LPS和50 mg M+LPS組小鼠黑質(zhì)部位HDAC6蛋白水平明顯下降(P<0.001)。見(jiàn)圖6。

    3 結(jié)論

    注:與對(duì)照組比較,***P<0.001;與LPS組比較, ###P<0.001圖5 小鼠黑質(zhì)部位p62蛋白表達(dá)變化(n=4)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01,***P<0.001;與LPS組比較,###P<0.001圖6 小鼠黑質(zhì)部位HDAC6蛋白表達(dá)變化(n=4)

    目前PD的病因尚不明確,黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死和α-synuclein的異常積聚是PD的主要病理特征。神經(jīng)炎癥是所有神經(jīng)退行性疾病的共同病理機(jī)制,受損神經(jīng)元和炎癥反應(yīng)之間存在著自我推進(jìn)式的惡性循環(huán),任何能打破該惡性循環(huán)的治療都應(yīng)該可以延緩該類(lèi)神經(jīng)疾病的進(jìn)展?;?qū)W分析提示,許多炎癥因子的DNA多態(tài)性是PD的危險(xiǎn)因素[8];抗炎藥物能降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活性,減少促炎癥因子的分泌,各國(guó)學(xué)者紛紛致力于尋找合適的藥物調(diào)控促炎因子的生成,從而在神經(jīng)退行性疾病的治療中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5,7]。

    本研究表明,25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素干預(yù)能明顯改善PD模型小鼠的急性運(yùn)動(dòng)障礙,減輕黑質(zhì)部位的急性炎癥反應(yīng),在一定程度上打破黑質(zhì)部位受損多巴胺神經(jīng)元和炎癥反應(yīng)之間自我推進(jìn)式的惡性循環(huán),有可能延緩多巴胺神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失。PD的發(fā)病與多種機(jī)制有關(guān),其中α-synuclein清除受損和自噬功能障礙是其中重要的一環(huán)。分泌至胞外的α-synuclein不僅會(huì)造成周?chē)窠?jīng)元的損傷[9],還可以激活周?chē)z質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生[10]。因此,能夠激活自噬的藥物可通過(guò)促進(jìn)α-synuclein清除來(lái)延緩疾病進(jìn)展[11]。本研究在證實(shí)了米諾環(huán)素的抗炎癥作用同時(shí),研究了小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein蛋白水平變化,發(fā)現(xiàn)25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素的預(yù)處理亦能緩解PD小鼠黑質(zhì)部位α-synuclein的異常聚集。因此,筆者有理由推測(cè)米諾環(huán)素可能通過(guò)減少α-synuclein的積聚而延緩PD的進(jìn)程。

    細(xì)胞自噬普遍存在于真核細(xì)胞中,是細(xì)胞通過(guò)自身形成的囊泡,吞噬胞漿內(nèi)變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過(guò)程[12]。在病理狀態(tài)或老化狀態(tài)下,將出現(xiàn)自噬激活和降解兩者間的失衡,導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白在體內(nèi)的積聚,細(xì)胞自噬功能障礙參與了PD的發(fā)生。研究表明,四環(huán)素類(lèi)抗生素米諾環(huán)素和替加環(huán)素具有誘導(dǎo)自噬的功能[13-14],米諾環(huán)素可以通過(guò)AMPKα1信號(hào)介導(dǎo)的自噬抑制輻射誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[15]。有研究者在PD病人的大腦黑質(zhì)中檢測(cè)到了空泡樣的自噬體,并且觀察到了LC3-Ⅱ的表達(dá)上調(diào)[16]。自噬的激活可能是有利于神經(jīng)元存活的保護(hù)性反應(yīng),但是過(guò)度激活將導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[17-18]。自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、HDAC6和p62三者與自噬的發(fā)生密切相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn)25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素干預(yù)組PD小鼠黑質(zhì)部位LC3-Ⅱ、HDAC6蛋白表達(dá)下降,自噬底物p62蛋白的表達(dá)量也出現(xiàn)同步下降,結(jié)合上述對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠相同部位α-synuclein蛋白表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果分析,可以合理推測(cè)PD模型小鼠黑質(zhì)部位的自噬應(yīng)激在25 mg/kg、50 mg/kg米諾環(huán)素預(yù)干預(yù)下有所緩解,自噬激活和降解間的失衡有所好轉(zhuǎn)。

    本研究結(jié)果顯示,75 mg M+LPS米諾環(huán)素干預(yù)組中LC3-Ⅱ、HDAC6的蛋白表達(dá)量較單獨(dú)LPS組進(jìn)一步增加,而且自噬產(chǎn)物p62和α-synuclein的水平也出現(xiàn)同步增加。與此同時(shí),單獨(dú)75 mg/kg米諾環(huán)素組實(shí)驗(yàn)小鼠黑質(zhì)部位的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組也有所增加,這一結(jié)果提示,高劑量的米諾環(huán)素可能存在某種機(jī)制導(dǎo)致自噬的過(guò)度激活,需要在后期的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)觀察及深入研究。另一方面也提示,單純激活自噬很可能是無(wú)效的,甚至是有害的,維持自噬激活和底物降解之間的平衡,促進(jìn)底物的降解可能具有更好的神經(jīng)保護(hù)作用。

    綜上所述,低、中劑量的米諾環(huán)素可保護(hù)LPS所致的小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷,減輕系統(tǒng)性炎癥所致黑質(zhì)部位的急性炎癥反應(yīng),平衡過(guò)度激活的自噬功能,促進(jìn)α-synuclein自噬性清除可能是其有效的作用機(jī)制。因此,米諾環(huán)素是PD治療的一個(gè)非常有潛力的靶點(diǎn)藥物,其在臨床應(yīng)用中的可行性、有效性和安全性等問(wèn)題則需要更多及更深入的研究。

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