腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)氨基糖苷類耐藥基因研究進(jìn)展

施清喻，胡付品

作者單位： 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，國(guó)家衛(wèi)健委臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200041。

氨基糖苷類抗菌藥物（aminoglycosides）通過(guò)結(jié)合原核生物30S核糖體亞基16S rRNA的高保守A位點(diǎn)，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成導(dǎo)致細(xì)菌的死亡[1]，現(xiàn)用于臨床革蘭陰性菌所致嚴(yán)重感染的治療及畜牧業(yè)中。按其作用部位可分為：①與A位點(diǎn)結(jié)合，4，6-二取代脫氧鏈霉胺類（如卡那霉素和慶大霉素）；4，5-二取代脫氧鏈霉胺類（如新霉素）。②非與A位點(diǎn)結(jié)合（如鏈霉素和大觀霉素）[2]。

但氨基糖苷類抗菌藥物由于其不良反應(yīng)，且隨著廣譜抗生素的出現(xiàn)，臨床應(yīng)用逐漸減少。近年多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌不斷出現(xiàn)，但首選治療藥物碳青霉烯類耐藥性卻逐年上升。耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）被列為三大最緊迫的抗菌藥物耐藥威脅之一?，F(xiàn)推薦的CRE感染治療方法是單用或聯(lián)合用氨基糖苷類、替加環(huán)素、黏菌素和新開(kāi)發(fā)的頭孢他啶-阿維巴坦（avycaz）[3]。其中氨基糖苷類的治療失敗率較低[4]，且隨著國(guó)家監(jiān)管力度的增強(qiáng)其使用安全性也得到了提高。但隨著臨床應(yīng)用，氨基糖苷類的耐藥性逐年上升。其中會(huì)導(dǎo)致氨基糖苷類廣泛高水平耐藥的16S rRNA需要引起臨床警惕，現(xiàn)就其基因環(huán)境及表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)行綜述。

1 質(zhì)粒介導(dǎo)16S rRNA甲基化氨基糖苷類耐藥機(jī)制

氨基糖苷類的常見(jiàn)耐藥機(jī)制有：①細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性改變、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)降低及主動(dòng)外排加強(qiáng)。②細(xì)菌的核糖體蛋白、16S rRNA突變導(dǎo)致抗菌藥物作用靶位改變。③細(xì)菌產(chǎn)生氨基糖苷鈍化酶，這是最常見(jiàn)的一種機(jī)制。氨基糖苷鈍化酶包括N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（aminoglycoside acetytransferase，AAC）、O-腺苷轉(zhuǎn)移酶（aminoglycoside nucleotidyltransferase，ANT； aminoglycoside adenylase，AAD） 和O-磷酸轉(zhuǎn)移酶 （aminoglycoside phosphotransferase，APH）。鈍化酶的修飾鈍化作用具有底物專一性，但存在雙功能鈍化酶，如AAC（6'）-APH（2"）酶可同時(shí)作用于6'位氨基和2"位羥基。這種酶在金葡菌、腸球菌中較為多見(jiàn)，在革蘭陰性菌中罕見(jiàn)。

氨基糖苷類抗菌藥物是由鏈霉菌屬、 小單孢菌屬等放線菌產(chǎn)生的，這些放線菌通過(guò)產(chǎn)16S rRNA甲基酶形成耐藥。根據(jù)甲基化的位點(diǎn)可將氨基糖苷類耐藥酶分為兩類：①A1408的N1位點(diǎn)甲基化，發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)天神霉素的鏈霉菌屬，主要包括KgmB、NbrB、Kmr，導(dǎo)致對(duì)卡那霉素和安普霉素耐藥，但對(duì)慶大霉素敏感；②G1405的N7位點(diǎn)甲基化，發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)慶大霉素絳紅小單孢菌，主要包括Grm、Sgm、FmrO，導(dǎo)致對(duì)卡那霉素和慶大霉素耐藥，對(duì)安普霉素敏感。兩者均作用于16S rRNA的A位點(diǎn)，它們的甲基化會(huì)阻止肽酰tRNA由A向P位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移，干擾蛋白質(zhì)翻譯[1]。

這一機(jī)制原不存在于臨床分離株中，但自2003年起，這種酶出現(xiàn)在臨床菌株中[5-6]。16S rRNA甲基化酶通過(guò)使16S rRNA的A位點(diǎn)特定核苷酸的甲基化，阻礙氨基糖苷類藥物與核糖體30S亞基結(jié)合，導(dǎo)致耐藥。先發(fā)現(xiàn)的ArmA、RmtA～RmtH作用于G1405位點(diǎn)，破壞與4，6-二取代脫氧鏈霉胺的結(jié)合[7]。而NpmA作用于A1408位點(diǎn)，同時(shí)阻礙了4，5-和4，6-二取代脫氧鏈霉胺[2]。除了會(huì)導(dǎo)致多種氨基糖苷類高水平耐藥，16S rRNA甲基化酶位于可移動(dòng)的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上易于傳播，需引起廣泛關(guān)注。

2 腸桿菌科質(zhì)粒介導(dǎo)16S rRNA甲基化酶基因相關(guān)研究

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10組甲基化酶：ArmA、RmtARmtH、NpmA[8]，見(jiàn)圖1。2002年首次檢測(cè)出16S rRNA甲基化酶[9]，2003年，Galimand等[5]發(fā)現(xiàn)其為ArmA。armA基因多位于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的復(fù)合轉(zhuǎn)座子上，后發(fā)現(xiàn)也可存在IS26或ISAba125復(fù)合轉(zhuǎn)座子相關(guān)的獨(dú)立環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與宿主質(zhì)粒共存[10]，仍不明確其確切起源。同年發(fā)現(xiàn)的RmtA，其基因位于接合型質(zhì)粒中的耐汞轉(zhuǎn)座子Tn5041上，在移動(dòng)元件κ-γ的兩個(gè)拷貝之間，該基因可能源于產(chǎn)氨基糖苷放線菌[11]。2004年，Doi等[12]發(fā)現(xiàn)RmtB，其基因與rmtA核酸序列相似性高。ArmA和RmtB是世界范圍報(bào)道最多的16S rRNA甲基化酶，雖然兩者都易攜帶blaCTX-M，但rmtB與blaCTX-M位于不同的質(zhì)粒[13]。2006年在奇異變形桿菌中發(fā)現(xiàn)RmtC[14]，與之前發(fā)現(xiàn)的16S rRNA甲基化酶相似性不高。RmtC的檢出率在一些地區(qū)僅次于ArmA和RmtB[15]。2007年，在巴西分離出同時(shí)產(chǎn)SPM-1金屬酶和RmtD的細(xì)菌[16]，在幾年后又發(fā)現(xiàn)了rmtD2[17]與rmtD3[18]基因型?，F(xiàn)RmtD相關(guān)報(bào)道主要集中于巴西，且有一定概率同時(shí)產(chǎn)SPM-1[19]。2010年RmtE首次分離自牛源性大腸埃希菌[20]，后在2013年于人體分離出[21]，5年后發(fā)現(xiàn)rmtE2基因型[22]，至今相關(guān)報(bào)道依舊十分罕見(jiàn)。2011年，在法國(guó)發(fā)現(xiàn)了RmtF，與RmtD編碼蛋白一致性較高[23-24]，其可能與放線菌的16S rRNA甲基化酶存在親緣關(guān)系[25]。2011年在巴西篩選出 5株產(chǎn)RmtG細(xì)菌，這5株均同時(shí)產(chǎn)CTX-M，有4株產(chǎn)KPC-2[26]。早先RmtG的報(bào)道主要在美洲[27]，2018年首次在歐洲出現(xiàn)[28]。2 年后檢測(cè)出RmtH[29]，該菌株同時(shí)攜帶blaCTX-M-15、blaSHV-1、blaOXA-1[30]。2007年發(fā)現(xiàn)了卡那霉素-阿泊拉霉素甲基轉(zhuǎn)移酶（Kam）家族的NpmA[2]。NpmA可能擁有m（1）A1408和m（1）G1408的雙重活性[31]。現(xiàn)在產(chǎn)NpmA的菌株依舊較為罕見(jiàn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)16S rRNA甲基化酶基因的相關(guān)研究見(jiàn)表.[32-45]。

圖1 革蘭陰性菌和放線菌16S rRNA甲基化酶無(wú)根樹(shù)圖

3 質(zhì)粒介導(dǎo)16S rRNA甲基化酶氨基糖苷類耐藥的臨床策略

氨基糖苷類抗菌藥物適合作為治療CRE的聯(lián)合用藥，特別是新一代氨基糖苷類plazomicin，在體外對(duì)多藥耐藥腸桿菌科細(xì)菌具有殺菌活性，包括產(chǎn)生廣譜β內(nèi)酰胺酶[46]、碳青霉烯酶[47]和大多數(shù)氨基糖苷鈍化酶[48]類細(xì)菌。但其體外活性會(huì)受16S rRNA甲基化酶的影響[48]。需警惕攜帶16S rRNA甲基化酶基因的CRE越發(fā)頻繁地出現(xiàn)。

而質(zhì)粒介導(dǎo)16S rRNA甲基化酶作為氨基糖苷類新發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制，雖未暴發(fā)性流行，但卻呈全球分布的趨勢(shì)。而在中國(guó)國(guó)內(nèi)，2004年首次在臺(tái)灣出現(xiàn)ArmA的相關(guān)報(bào)道[49]，后在2012年國(guó)內(nèi)分離出了RmtB[50]，它們是國(guó)內(nèi)分離率最高的2種16S rRNA甲基化酶。近年又分別檢出了RmtE[51]、NpmA[25]、RmtA[52]。需要警惕的是，由于氨基糖苷類藥物在獸醫(yī)學(xué)中的廣泛運(yùn)用，動(dòng)物中出現(xiàn)了產(chǎn)16S rRNA甲基化酶的致病菌株[9，43]，可能通過(guò)食物向人類傳播。

表1 16S rRNA 甲基化酶相關(guān)基因

此外16S rRNA甲基化酶由于其耐藥特性，也需臨床的充分重視。其一，16S rRNA甲基化酶會(huì)介導(dǎo)革蘭陰性桿菌對(duì)大多數(shù)臨床常用氨基糖苷類抗菌藥物極高水平耐藥，且無(wú)法通過(guò)提高劑量糾正。其二，所有已知的16S rRNA甲基化酶的結(jié)構(gòu)基因均位于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，且與可移動(dòng)遺傳因子相關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致水平傳播。其三，這些細(xì)菌易發(fā)展為多重耐藥，尤其是與各種β內(nèi)酰胺酶基因聯(lián)合耐藥。所以盡早篩選出16S rRNA甲基化基因?qū)εR床的預(yù)防和治療相當(dāng)重要。

在檢測(cè)16S rRNA甲基化酶時(shí)，較易與產(chǎn)多種鈍化酶的細(xì)菌混淆，且兩者可同時(shí)存在?？敲顾氐难苌锇⒇惪ㄐ强傻挚光g化酶的作用，僅少數(shù)產(chǎn)雙功能酶可導(dǎo)致耐藥，若其高水平耐藥則懷疑產(chǎn)16S rRNA甲基化酶。有建議當(dāng)出現(xiàn)對(duì)所有氨基糖苷類藥物耐藥的腸桿菌科細(xì)菌、不動(dòng)桿菌或銅綠假單胞菌時(shí)，先進(jìn)行慶大霉素、阿米卡星的紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，若可獲得阿貝卡星也應(yīng)檢測(cè)，確認(rèn)無(wú)抑菌圈后進(jìn)行多重PCR，以此檢測(cè)16S rRNA甲基化酶基因[6]。

當(dāng)在臨床遇到產(chǎn)16S rRNA甲基化酶革蘭陰性菌時(shí)，應(yīng)該高度關(guān)注其抗菌譜，可篩選是否產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）。當(dāng)接觸高度疑似或確診產(chǎn)16S rRNA甲基化酶和ESBL或產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶細(xì)菌感染的患者時(shí)，需采取一定的接觸預(yù)防措施。

4 結(jié)語(yǔ)

雖然人們還未明確16S rRNA甲基化酶的來(lái)源，但由于其可介導(dǎo)多數(shù)氨基糖苷類抗菌藥物高水平耐藥，基因結(jié)構(gòu)可移動(dòng)性且易形成多重耐藥的特性，使其成為臨床治療的嚴(yán)重問(wèn)題。截止目前，在世界各地紛紛出現(xiàn)了產(chǎn)16S rRNA甲基化酶細(xì)菌，在我國(guó)也出現(xiàn)了相應(yīng)報(bào)道。不同地區(qū)產(chǎn)酶基因的分布情況存在較大差異，可在相應(yīng)地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，分析其傳播途徑，揭示其基因環(huán)境，這將對(duì)臨床治療與藥物研發(fā)提供幫助。對(duì)于醫(yī)務(wù)人員和流行病學(xué)工作者，早期篩查攜帶該基因的病原菌，加強(qiáng)對(duì)此類耐藥菌株的監(jiān)控，以防止其廣泛傳播至關(guān)重要。