口腔黏膜良性淋巴組織增生病中肥大細(xì)胞與微血管的相關(guān)性研究

張 昊 敦鈴霞 謝以婷 李荷香 宋 鵬 劉慧娟 侯亞麗

口腔黏膜良性淋巴組織增生病（benign lymphoadenosis of oral mucosa，BLOM）是一種慢性炎癥性口腔黏膜病，但由于其誤診率高，其病因和發(fā)病機(jī)制至今不甚清楚，治療效果不佳。因此，探討其發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)勢(shì)在必行。目前，越來(lái)越多的證據(jù)[1]表明肥大細(xì)胞（mast cell，MC）對(duì)炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。而血管生成現(xiàn)象又是慢性炎癥過(guò)程發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。那么BLOM 中肥大細(xì)胞密度（mast cell density，MCD）和微血管密度（microvessel density，MVD）的關(guān)系如何？目前國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)BLOM 中MCD 和MVD，探討其相關(guān)性，為研究BLOM 發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)提供線索。

資料和方法

一、材料

1.研究對(duì)象：30 例BLOM 蠟塊均來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院病理科作為BLOM 組。15 例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對(duì)照組。30 例BLOM 患者均無(wú)移植物抗宿主疾病、丙型肝炎或艾滋病毒感染；活檢前近六個(gè)月均沒(méi)有接受過(guò)局部或全身治療。

2.試劑：肥大細(xì)胞類胰蛋白酶單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司、CD105 單克隆抗體、PV-9000 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.免疫組織化學(xué)染色法：將BLOM 組和正常對(duì)照組蠟塊分別切成厚度為3～4 微米的切片，常規(guī)脫蠟至水，0.01MPBS 沖洗5min×3 次，放入枸櫞酸緩沖液中熱修復(fù)，一抗類胰蛋白酶抗體滴度為1:1000，CD105 抗體滴度為1:100，以后按PV9000 試劑盒說(shuō)明書操作，蘇木素復(fù)染，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。陽(yáng)性對(duì)照采用已知的陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照用PBS 代替一抗。

2.MCD 和MVD 計(jì)數(shù)：分別將BLOM 組和正常對(duì)照組每張切片在低倍鏡（×40）下選取肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和CD105 染色最密集的部位，高倍鏡（×400）下計(jì)數(shù)。凡胞漿呈現(xiàn)棕黃色或黃褐色的為陽(yáng)性肥大細(xì)胞。胞漿呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色的單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇（小于3～5 個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞），與鄰近結(jié)締組織界限明顯者計(jì)為一個(gè)獨(dú)立的微血管。每張切片計(jì)數(shù)3 個(gè)高倍視野下肥大細(xì)胞數(shù)量和微血管數(shù)目，取其均值，分別作為MCD 和MVD 值。MCD 和MVD 計(jì)數(shù)由2 名病理科醫(yī)師采用雙盲法完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Spearman 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.一般情況：30 例BLOM 中，男性11 例（36.67%），平均年齡56.2727±16.10025 歲，女性19 例（63.33%），平均年齡，53.5789±10.93575 歲。病程0.5～240 個(gè)月不等。15 例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對(duì)照組。其中男性7 例（46.67%），平均年齡58.8571±10.33487 歲、女性8 例（53.33%），平均年齡56.3750±8.38259 歲。

表1 BLOM 組和正常對(duì)照組MCD 和MVD 的關(guān)系

2.結(jié)果（表1）。

BLOM 組和正常對(duì)照組均有類胰蛋白酶陽(yáng)性的MC（圖1～2），30 例BLOM 中MCD 范圍21～195.67，均值55.0183±34.45887；正常對(duì)照組MCD 范圍13～35.67，均值19.9554±5.29479。兩組比較，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 MC 在BLOM 組的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色 ×200）

圖2 MC 在正常對(duì)照組的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色 ×200）

圖3 CD105 在BLOM 的表達(dá)（免疫組織化學(xué)×200）

圖4 CD105 在正常對(duì)照組的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色 ×200）

CD105 陽(yáng)性MVD 在BLOM 組為陽(yáng)性表達(dá)（圖3），在正常對(duì)照組幾乎為陰性（圖4）。BLOM 中MVD范圍9.33～29，均值19.8850±6.21789；正常對(duì)照組MVD 范圍0～2，均值1.0000±0.80178。兩組比較，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Spearman 等級(jí)相關(guān)分析顯示BLOM 組MCD 與MVD 呈正相關(guān)（r＝0.619，P＜0.01）。

討論

BLOM 是一種臨床并不少見(jiàn)的口腔黏膜病，但由于其復(fù)雜的臨床表現(xiàn)和高誤診率，治療效果不佳，易反復(fù)復(fù)發(fā)出現(xiàn)癌變。

MC 來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，是一種結(jié)締組織的主要效應(yīng)細(xì)胞，在炎癥過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。研究已表明多種口腔炎癥性疾病如口腔扁平苔蘚[2]，牙周炎[3]，根尖周囊腫[3]中都發(fā)現(xiàn)有MC 浸潤(rùn)的增高。MC 胞漿中含有異染顆粒，其中類胰蛋白酶是含量最多的介質(zhì)。BLOM 病理特征是在不同程度淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和粒細(xì)胞浸潤(rùn)背景上有淋巴濾泡形成或淋巴細(xì)胞灶狀聚集，這說(shuō)明BLOM 是一種慢性炎癥性口腔黏膜病。Scardina 等[4]認(rèn)為血管生成現(xiàn)象是慢性炎癥過(guò)程發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。目前，大多數(shù)研究者常采用CD31、CD34 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等廣泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物檢測(cè)MVD[5]。但是這些泛血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物對(duì)新生血管缺乏特異性，對(duì)組織中所有內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，而CD105 僅對(duì)活化的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。因此，CD105 被研究者認(rèn)為是一種新生血管的特異標(biāo)記物[6，7]。本研究結(jié)果顯示，BLOM 中MCD 較對(duì)正常照組明顯升高，與平昭等研究結(jié)果相似。CD105 標(biāo)記的MVD 在正常對(duì)照組陰性表達(dá)，在BLOM 組陽(yáng)性表達(dá)，兩組相比較，CD105-MVD 數(shù)目有顯著性差異，這說(shuō)明BLOM 中存在明顯的血管生成現(xiàn)象，與李曙霞[8]等研究結(jié)果一致。Sheelam S[9]等認(rèn)為血管生成會(huì)導(dǎo)致更多淋巴細(xì)胞的募集和保留，從而加重炎癥，使疾病進(jìn)展或病變復(fù)發(fā)，導(dǎo)致癌變。因此，靶向血管形成的各種分子和途徑的治療可以更好地控制潛在惡性疾病的進(jìn)展。有研究[10]表明血管生成在口腔黏膜白斑惡性轉(zhuǎn)變的早期階段就已經(jīng)開(kāi)啟。但是否也在BLOM 癌變的早期階段開(kāi)啟了血管的生成，有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果還顯示BLOM 組MCD 和MVD 存在正相關(guān)性，進(jìn)一步說(shuō)明了MC 參與了BLOM 中血管的新生，為尋找BLOM 新的治療靶點(diǎn)提供了線索。BLOM 是某種刺激因素導(dǎo)致的淋巴組織的反應(yīng)性增生性疾病。細(xì)菌、病毒或者某種刺激可能在一定條件下激活MC，使MC 脫顆粒，分泌肝素、組胺、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和類胰蛋白酶等多種促血管生成因子[3]誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。MC 在脫顆粒的的同時(shí)，也可以合成并分泌TNF-α，而TNF-α 能夠上調(diào)C-C 趨化因子受體1 型和RANTES 表達(dá)[11]，從而觸發(fā)MC 進(jìn)一步脫顆粒，釋放促血管生成因子，引起白細(xì)胞遷移、加重炎癥和導(dǎo)致血管新生。