手足口病患兒細胞免疫功能與相關(guān)細胞因子水平變化的臨床研究

陳星，戢敏，喻雪琴，陳芳，梅怡晗，梅小平

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科，四川 南充 637000；2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

手足口?。╤and foot and mouth disease, HFMD）是兒科的一種常見傳染病，主要由腸道病毒感染所致，具有傳染性強、傳播快的臨床特點。絕大多數(shù)患兒病情呈自限性發(fā)展，少數(shù)患兒可發(fā)展至重型HFMD。多數(shù)學(xué)者認為，HFMD的發(fā)生機制與細胞免疫功能異常和相關(guān)細胞因子水平失衡相關(guān)[1-3]。筆者就HFMD患兒循環(huán)血T巴細胞亞群、NK細胞、白細胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）、白細胞介素-17（Interleukin-10, IL-17）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis facto, TNF-α）表達水平的變化進行臨床研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年1月—2018年6月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的68例HFMD患兒作為觀察組。其中，男性42例，女性26例；年齡（3.12±1.28）歲；根據(jù)臨床病情程度：普通型42例，重癥型26例。HFMD診斷符合2010年國家衛(wèi)計委辦公廳頒布的《手足口病診療指南》中的診斷標準及分型[4]。隨機選取同期門診健康體檢的25例兒童作為對照組。其中，男性17例，女性8例；年齡（3.27±1.21）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

收集HFMD患兒循環(huán)靜脈血標本、年齡、性別、病史、癥狀、體征及輔助檢查等臨床資料；同時檢測HFMD患兒、對照組兒童的循環(huán)靜脈血病原學(xué)、T淋巴細胞亞群、NK細胞、IL-10、IL-17及TNF-α的表達水平。

1.3 標本采集

觀察組在入院隔日清晨、對照組兒童在體檢時清晨抽取循環(huán)血標本2 ml置于EDTA抗凝的試管內(nèi)，循環(huán)靜脈血標本離心后血清在≤-20℃低溫冷凍保藏，血清檢測采用中和抗體測定法。具體檢測方法依據(jù)衛(wèi)生部《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[5]。

1.4 病毒學(xué)檢測

采用美國ABi公司的ABI7300熒光定量PCR儀和江蘇默樂生物科技有限公司生產(chǎn)的EV71、CoxA16及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒，運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測EV、腸道病毒71（Enterovirus-71, EV-71）及CA16等腸道病毒RNA，嚴格按照說明書由專人進行操作。

1.5 循環(huán)血T細胞亞群檢測

以美國BD公司生產(chǎn)的FACS Calibur流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群，取觀察組與對照組的循環(huán)靜脈血2 ml EDTA-K2抗凝。在各試管中加入10μl由CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC和CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC組成的4標記單克隆抗體，同時加入100μl抗凝循環(huán)靜脈血混勻并標記30 min，加入固定劑30μl固定5～10 min；加入紅細胞溶解液1 ml溶解紅細胞10～20 min，最后加磷酸鹽緩沖液后用流式細胞儀計數(shù)10 000個淋巴細胞并進行分檢。

1.6 循環(huán)血清細胞因子IL-10、IL-17及TNF-α水平檢測

采集觀察組和對照組循環(huán)靜脈血2 ml，離心后留取血清在≤-20℃低溫冷凍保藏，采用美國ADLD公司試劑盒及Rayto RT-6100型酶標儀，酶聯(lián)免疫法檢測血清IL-10、IL-17及TNF-α水平。

1.7 治療后T細胞亞群及炎癥因子的檢測

入院治療后第7天清晨再次抽取循環(huán)靜脈血標本2 ml置于含EDTA抗凝的試管內(nèi)，循環(huán)靜脈血標本離心后血清在≤-20℃低溫冷凍保藏，其T細胞亞群及血清細胞因子IL-10、IL-17及TNF-α的檢測方法、試劑與檢測人員等與入院初次檢測一致。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或配對t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、年齡比較，經(jīng)t檢驗或χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 HFMD腸道病毒感染分布及構(gòu)成比分析

68例HFMD患兒腸道病毒感染以單一病毒最為常見；其中EV-71構(gòu)成比最高，EV-71+CA16構(gòu)成比位居第2位。所有病毒感染后的RNA檢測為陽性。見表2。

表2 HFMD患兒腸道病毒感染分布及構(gòu)成比

2.3 兩組治療前細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平

兩組治療前CD4+T、CD8+T及NK細胞水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組CD4+T、CD8+T及NK細胞水平低于對照組（P＜0.05）。兩組治療前IL-10、IL-17及TNF-α水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組IL-10、IL-17及TNF-α水平高于對照組（P＜0.05）。見表3。

2.4 不同病情程度HFMD患兒細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平

重型HFMD組與普通型HFMD組治療前CD4+T、CD8+T及NK細胞水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；重型HFMD組CD4+T、CD8+T水平低于普通型HFMD組，而NK細胞水平高于普通型HFMD組（P＜0.05）。重型HFMD組與普通型HFMD組IL-10、IL-17及TNF-α水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），重型HFMD組IL-10、IL-17及 TNF-α 高 于 普 通 型 HFMD 組（P＜0.05）。見表4。

2.5 觀察組治療前后循環(huán)血細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平變化

觀察組治療7 d后與治療前CD4+T、CD8+T、NK細胞水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后CD4+T、CD8+T及NK細胞水平較治療前高（P＜0.05）。觀察組治療 7 d 后與治療前的IL-10、IL-17及TNF-α水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后的IL-10、IL-17濟 TNF-α水平較治療前低（P＜0.05）。見表5。

表3 兩組治療前細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平比較 （±s）

表3 兩組治療前細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平比較 （±s）

組別 n CD4+T/% CD8+T/% NK 細胞 /% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）對照組 25 40.551±1.282 22.570±3.322 9.692±1.232 25.352±1.784 26.253±1.771 1.874±0.223觀察組 68 34.542±2.363 17.522±2.091 8.463±1.554 33.764±4.143 35.854±3.933 3.473±0.504 t值 16.323 8.223 3.614 13.132 15.501 20.543 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 不同病情程度HFMD患兒細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平比較 （±s）

表4 不同病情程度HFMD患兒細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平比較 （±s）

組別 n CD4+T/% CD8+T/% NK細胞/% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）普通型HFMD組 42 45.124±1.734 26.014±1.234 3.154±0.253 30.881±1.972 33.243±2.401 3.133±0.284重型 HFMD 組 26 20.081±1.323 20.454±2.243 18.423±1.684 38.422±1.724 40.082±1.353 4.033±0.154 t值 63.232 11.553 46.094 16.093 15.023 17.092 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 觀察組治療前后循環(huán)血細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平變化 （n =68，±s）

表5 觀察組治療前后循環(huán)血細胞免疫功能及相應(yīng)細胞因子水平變化 （n =68，±s）

時間 CD4+T/% CD8+T/% NK細胞/% IL-10/（pg/ml） IL-17/（pg/ml） TNF-α/（pg/ml）治療前 34.542±2.358 17.502±2.091 8.462±1.545 33.763±4.143 35.852±3.931 3.473±0.502治療后 37.382±1.683 22.471±3.320 9.572±1.733 27.622±2.174 28.724±1.991 1.853±0.192 t值 8.062 10.441 3.962 11.294 13.334 25.002 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

HFMD是兒童中常見的一種傳染性疾病，臨床以發(fā)熱、手掌、足、臀及口腔等多部位皮疹為特征，其主要由EV71、CA16等20多種人腸道病毒感染所致。近5年來，在中國乃至全世界EV-71型腸道病毒已成為最常見的HFMD病原體。EV-71感染后，HFMD患兒可呈現(xiàn)自限性痊愈，重癥化時常出現(xiàn)肺部感染、心肺功能衰竭甚至死亡[6-8]。為此，探索HFMD的發(fā)病機制顯得尤其重要。分析68例HFMD患兒后筆者發(fā)現(xiàn)，以單一EV-71感染最為常見；其次為EV-71+CA16的混合感染，這與朱其榮等[9]報道相一致。

目前，HFMD的發(fā)病機制不詳，有學(xué)者認為，可能與患兒在感染EV-71、CA16等后機體出現(xiàn)免疫功能失衡與紊亂相關(guān)[10]。機體細胞免疫調(diào)控作用可通過CD8+T淋巴細胞直接殺傷病毒，也可通過CD4+T淋巴細胞活化B淋巴細胞來增強體液免疫反應(yīng)來抑制病毒。CD4+T、CD8+T及NK細胞在機體免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究顯示，觀察組患兒治療前CD4+T、CD8+T及NK細胞水平較對照組低，表明EV-71感染后，HFMD患兒出現(xiàn)細胞免疫功能紊亂，大量的CD4+T、CD8+T淋巴細胞發(fā)揮抗病毒效應(yīng)后通過Fas/FasL通路來誘導(dǎo)免疫細胞出現(xiàn)了程序性凋亡[11-12]。隨著HFMD患兒病情加重，重型HFMD患兒CD4+T、CD8+T細胞水平較普通型HFMD下調(diào)明顯，表明在HFMD重癥化時，免疫細胞活化，大量免疫細胞耗竭；CD4+T、CD8+T表達頻率下調(diào)，病毒的清除能力下降，導(dǎo)致疾病重癥化，這與符青松等[13]和BENNETT等[10]研究結(jié)果一致。

有研究顯示，患兒感染EV-71后，機體會釋放各種細胞因子來誘導(dǎo)機體特異性或非特異性炎癥的發(fā)生，同時對病毒發(fā)揮清除與抑制作用，最大限度地促進疾病痊愈[14]。在機體免疫功能低下時，大量促炎癥因子釋放誘導(dǎo)組織損傷，導(dǎo)致疾病重癥化。本研究顯示，觀察組患兒IL-10、IL-17及TNF-α表達水平較對照組上調(diào)，表明HFMD患兒在感染EV-71等病毒后，活化的T淋巴細胞釋放大量IL-17、TNF-α等促炎癥因子，機體通過免疫反應(yīng)抗病毒的同時也導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這與李宏波等[15]結(jié)果一致。IL-10是抑炎因子代表，能抑制機體促炎因子的釋放，減輕細胞氧化反應(yīng)，抑制T細胞活化增殖。本結(jié)果顯示，觀察組抑炎因子IL-10較對照組升高，表明HFMD患兒被EV-71感染后，機體為減輕自我損傷會同時釋放抑炎因子來維持促炎因子與抑炎因子的平衡。一旦促炎性因子與抑炎因子比例失衡時，可能會導(dǎo)致HFMD重癥化，這與孫林春[11]的研究結(jié)果相似。經(jīng)過治療，在病程第7天觀察組CD4+T、CD8+T及NK細胞水平較治療前高，而IL-10、IL-17及TNF-α水平較治療前低，表明HFMD患兒在病情好轉(zhuǎn)時，T淋巴細胞可回升至常態(tài)，細胞免疫功能由紊亂趨向平衡；同時抑制IL-10、IL-17及TNF-α下降，糾正機體免疫紊亂與細胞因子水平的失衡狀態(tài)。

綜上所述，患兒免疫功能紊亂與細胞因子水平失衡在HFMD的發(fā)病機制中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，但確切的HFMD發(fā)病機制有待進一步研究[16-17]。因此，通過上述指標檢測對手足口病的病情及預(yù)后判斷可能有一定的指導(dǎo)作用。