大腸癌中自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相關(guān)性

（嘉興市第二醫(yī)院 腫瘤外科，浙江 嘉興 314000）

細(xì)胞自噬是真核生物普遍存在的一種自穩(wěn)機(jī)制，在細(xì)胞自我保護(hù)、胚胎發(fā)育及生物生存等機(jī)體正常生理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。自噬失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1]，近年來(lái)大量研究表明自噬參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體機(jī)制尚不明確[2-3]。JAK2/STAT3信號(hào)通路在大腸癌的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[4]。本文通過(guò)研究自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路在大腸癌中的相關(guān)性，為探索大腸癌的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料

收集2015年7月-2016年12月嘉興市第二醫(yī)院腫瘤外科大腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本93例。根據(jù)2010年WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[5]，患者均經(jīng)病理學(xué)專家檢查確認(rèn)。其中，男性51例，女性42例；年齡25～83歲，平均（62.18±6.39）歲；腫瘤直徑≥5 cm 59例，＜5 cm 34例；發(fā)病部位：結(jié)腸38例，直腸55例；腫瘤分化程度：高分化29例，中分化46例，低分化18例；組織類型：管狀腺癌78例，黏液腺癌15例；浸潤(rùn)深度：黏膜及黏膜下層3例，肌層11例，外膜79例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例。大腸癌標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本取材分別在癌灶中央的非壞死區(qū)和遠(yuǎn)離癌組織5 cm的區(qū)域，經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛溶液固定24 h，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)?；颊呔鶠槭状伟l(fā)現(xiàn)，患者術(shù)前未行任何放化療、靶向治療等抗腫瘤治療。

1.2 試劑

兔抗人LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3均購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)采取免疫組織化學(xué)法檢測(cè)LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3在大腸癌組織，以及癌旁組織中的表達(dá)，具體步驟如下：脫蠟水化，梯度酒精水化，3%過(guò)氧化氫H202孵育15 min，PBS沖洗3次，放入pH值6.0的拘椽酸鈉緩沖液中，在100℃高壓鍋內(nèi)1 min暴露抗原，PBS沖洗3次，添加適量聚合物輔助劑孵育20 min，PBS沖洗3次，DAB試劑盒顯色，充分清洗，蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精分化1 s，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，自來(lái)水沖洗，二甲苯處理3次，中性樹(shù)膠封片。

1.3.2 結(jié)果判定LC3、p62及p-JAK2陽(yáng)性著色部位位于細(xì)胞質(zhì)，在每張切片上隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（400倍），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行結(jié)果判斷。著色強(qiáng)度：不著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例≤5%計(jì)0分，＞5%～25%計(jì)1分，＞25%～50%計(jì)2分，＞50%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。將著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分乘積作為最終評(píng)分結(jié)果，≥4分為陽(yáng)性表達(dá)，＜4分為陰性表達(dá)。p-STAT3陽(yáng)性著色位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性標(biāo)志，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞百分比，將陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥50%作為高表達(dá)組，＜50%作為低表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中LC3、p62的表達(dá)及其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

LC3和p62主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，為黃褐色或棕褐色顆粒（見(jiàn)圖1），大腸癌與癌旁組織中LC3陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。不同分化程度LC3陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高、中分化低于低分化。有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LC3陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見(jiàn)表1、2。

大腸癌與癌旁組織p62陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），大腸癌組織低于癌旁組織。不同分化程度患者p62陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高、中分化高于低分化。有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p62陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。LC3、p62表達(dá)情況與患者性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤部位無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn) 1、2。

圖1 大腸癌及其癌旁組織中自噬相關(guān)蛋白和STAT3信號(hào)通路的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

2.2 不同組織中JAK/STAT3通路相關(guān)分子的表達(dá)及其與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

p-JAK2陽(yáng)性表達(dá)染色主要定位于細(xì)胞漿（見(jiàn)圖1）。大腸癌與癌旁組織p-JAK2陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。p-JAK2的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位無(wú)關(guān)（P＞0.05）。不同分化程度患者p-JAK2陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高、中分化低于低分化。有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p-JAK2陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見(jiàn)表1、2。

p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)染色主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿（見(jiàn)圖1）。大腸癌與癌旁組織中p-STAT3陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。p-STAT3的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位無(wú)關(guān)（P＞0.05）。不同分化程度p-JAK2陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高中分化低于低分化。有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p-JAK2陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見(jiàn)表2。

表1 大腸癌與癌旁組織的LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3陽(yáng)性率比較 [n =93，例（%）]

表2 不同因素大腸癌患者LC3、p62、p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性率比較 例（%）

續(xù)表2

2.3 自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相關(guān)性

大腸癌中自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)與p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)均呈正相關(guān)（rs=0.315和0.295，P=0.001和0.003）， 而p62的表達(dá) 與p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.320和-0.326，均P=0.001）。見(jiàn)表3。

表3 LC3、p62與p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討論

自噬與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其在腫瘤發(fā)展中的作用也越來(lái)越受到重視。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3作為哺乳動(dòng)物自噬體形成，以及胞漿到空泡靶向囊泡所必需的一種蛋白，常用來(lái)作為自噬體的標(biāo)志性蛋白之一，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3表達(dá)情況可在某些程度上反映自噬體數(shù)量[6]。自噬過(guò)程中，p62蛋白與待降解蛋白結(jié)合，并包裹到自噬體中，然后被特異性降解，因此p62蛋白的表達(dá)與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示大腸癌中LC3陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，而p62在大腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，且隨著癌組織的分化程度越低，LC3陽(yáng)性表達(dá)升高而p62陽(yáng)性表達(dá)率降低。表明大腸癌組織中的自噬水平明顯高于癌旁組織，且自噬水平與癌組織的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，組織分化程度越低，自噬水平越高；且出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者自噬水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相一致[7]。

JAK2-STAT3信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是一條與多種腫瘤的形成和發(fā)展關(guān)系密切的信號(hào)通路[8-12]。有研究表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-JAK2和p-STAT3在大腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，且與組織分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，p-JAK2和p-STAT3在高、中分化癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于低分化癌組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織，表明JAK2-STAT3信號(hào)通路的高表達(dá)可能與大腸癌的惡性程度有關(guān)，這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[14]。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路與癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[15-17]。多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)，敲除JAK2可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[18-20]。因此推測(cè)，大腸癌中自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路可能存在關(guān)聯(lián)。本研究通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中LC3的表達(dá)與p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)均呈正相關(guān)，p62的表達(dá)與p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。提示大腸癌中自噬活性的升高與JAK2/STAT3信號(hào)通路密切相關(guān)。

綜上所述，在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中，自噬相關(guān)蛋白與JAK2/STAT3信號(hào)通路通過(guò)內(nèi)在的分子機(jī)制相互協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞向惡性方向發(fā)展。因此，對(duì)兩者的深入研究有利于揭示大腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制，為早期發(fā)現(xiàn)、治療大腸癌提供新的理論依據(jù)。后續(xù)研究需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以獲得更為可靠的研究數(shù)據(jù)。