生牛奶中分離大腸桿菌對(duì)季銨鹽類消毒劑耐藥性研究

郭莉娟，孫豐慧，張艷嬌 ，劉海鋒，廖小微，代敏*

(1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，成都610500；2.成都醫(yī)學(xué)院，四川省動(dòng)物源性獸藥殘留防控工程實(shí)驗(yàn)室，成都610500)

大腸桿菌Escherichiacoli可導(dǎo)致腹瀉，感染某些致病性較強(qiáng)的血清型時(shí)還可能致命，因此，被很多國(guó)家作為各類食品污染狀況的指示菌進(jìn)行檢測(cè)，是保障食品安全的重要指標(biāo)之一(Nyachuba，2010)。牛奶在人類的日常生活飲食結(jié)構(gòu)中的作用和地位不可替代(Bahareh，2010)，牛奶制品在生產(chǎn)加工過(guò)程中極易成為微生物的“繁殖基地”，其中大腸桿菌污染較為常見(Riffonetal.，2001)。因此，在牛奶的生產(chǎn)加工過(guò)程中需使用消毒劑(馬保瑞，2013)。

季銨鹽類(quaternary ammonium compounds，QACs)消毒劑是一類高效、低毒的消毒劑，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖、食品加工設(shè)備與器皿消毒、環(huán)境與物體表面消毒等(張卓娜等，2018)。隨著消毒劑的不合理使用，研究報(bào)道多種細(xì)菌對(duì)QACs消毒劑產(chǎn)生了耐藥性(姜曉冰等，2016；Hanetal.，2019)。目前消毒劑耐藥基因主要有5種染色體型耐藥基因[sugE(c)、emrE、ydgE、ydgF、mdfA](Edgar &Bibi，1997；Bayetal.，2008)，除mdfA基因?qū)儆贛FS家族外，sugE(c)、emrE、ydgE和ydgF基因?qū)儆赟MR家族；5種可移動(dòng)原件(質(zhì)粒、整合子或轉(zhuǎn)座子)介導(dǎo)的耐藥基因qacE、qacEΔ1、qacF、qacG和sugE(p)屬于SMR家族(Ployetal.，1998；Kuckenetal.，2000；Lietal.，2010；郭莉娟等，2014)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)從奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中分離的牛奶源大腸桿菌對(duì)4種QACs消毒劑的最低抑菌濃度(MIC)值，并對(duì)10種QACs消毒劑耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，旨在研究大腸桿菌對(duì)QACs消毒劑的耐藥現(xiàn)狀，為消毒劑正確使用、預(yù)防和控制食源性致病菌QACs耐藥提供理論依據(jù)，對(duì)保障食品質(zhì)量安全也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

第一次從四川省綿陽(yáng)市某牧場(chǎng)采集生牛奶樣品55個(gè)，第二次從四川省成都市青白江區(qū)某牧場(chǎng)采集生牛奶樣品19個(gè)，2次共采樣74個(gè)。樣品采集后裝入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室24 h內(nèi)處理完畢。

1.2 儀器與試劑

培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨(BPW)、麥康凱(MacConkey broth)、伊紅美藍(lán)(EMB)、大豆酪蛋白瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基均由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；水解酪蛋白瓊脂(MHA)培養(yǎng)基(Oxoid，英國(guó))。

消毒劑：十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、苯扎氯銨(BC)、雙十烷基二甲基氯化銨(DDAC)(成都貝斯特試劑有限公司)；氯代十六烷基吡啶(CPC)(成都市科龍化工試劑廠)。質(zhì)控菌株大腸桿菌(ATCC 10536)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院應(yīng)用微生物學(xué)系饋贈(zèng)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

消毒劑耐藥性基因的10對(duì)引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

1.4 菌株的分離

分別取25 mL樣品置于500 mL無(wú)菌袋中，加入225 mL BPW，劇烈搖晃；取50 mL加入無(wú)菌三角燒瓶中，加入50 mL雙倍麥康凱液體培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，劃線至EMB瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h。挑選EMB平板上典型大腸桿菌菌落劃線到TSA平板，最后經(jīng)革蘭氏染色鑒定后，保存至含15%～20%甘油的TSB培養(yǎng)基中，-80 ℃凍存?zhèn)溆?何雪梅等，2014)。大腸桿菌分子鑒定利用16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGATACCTTGTTACG-ACTT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，確定該批牛奶樣品中大腸桿菌的檢出率。

1.5 消毒劑最低抑菌濃度測(cè)定

1.5.1 菌懸液與消毒劑平板制備參照藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(Clinical and Laboratory Standards Institute，2017)測(cè)定消毒劑的MIC。蘸取大腸桿菌及質(zhì)控菌株純培養(yǎng)物菌液，劃線于NA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，用棉簽蘸取3～5個(gè)單菌落加入3 mL 生理鹽水中，充分混勻，制備為0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，?00 μL菌懸液加到含有1.8 mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋。

表1 季銨鹽類消毒劑耐藥基因引物及序列Table 1 Primers for quaternary ammonium compounds disinfectant resistance genes

采用二倍稀釋法制備消毒劑平板，分別將4種消毒劑稀釋到所需的濃度梯度，然后將不同濃度的消毒劑分別定量(2 mL)加入到平皿中，再向平皿中加入18 mL MHA培養(yǎng)基充分混勻，制成含有不同濃度消毒劑(0.125 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、……、1 024 mg·L-1)的MHA培養(yǎng)基平板。每個(gè)濃度3個(gè)平行組。

1.5.2 接種培養(yǎng)利用多點(diǎn)接種儀接種，吸取上述操作制備好的菌液1 mL置于接種儀配套的玻璃試管中，按消毒劑濃度從低到高的順序依次放置MHA瓊脂平板，菌液依次接種，每接種點(diǎn)細(xì)菌數(shù)約為1.5×104CFU。接種完后平板正向靜置約10 min后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.5.3 MIC值判讀培養(yǎng)完成后，將上述MHA平板放置于暗色且不反光的桌面上，仔細(xì)觀察平板上各接種處的菌斑生長(zhǎng)情況，以判斷實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。以完全不見某細(xì)菌生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的消毒劑濃度MHA平板為該消毒劑對(duì)該細(xì)菌的MIC，對(duì)大腸桿菌消毒劑的MIC值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 消毒劑抗性基因檢測(cè)

1.6.1 模板制備采用煮沸法制備模板。將無(wú)菌棉簽用無(wú)菌水潤(rùn)濕，并輕輕刮取NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的3～5個(gè)菌落，使菌落完全掉落在有700 μL無(wú)菌水的1.5 mL離心管中，煮沸10 min后，13 000 r·min-12 min，上清液即可作PCR模板(何雪梅等，2014)。

NM360襯板具有如下特點(diǎn)：① 強(qiáng)度高，具有高的屈服強(qiáng)度和抗拉強(qiáng)度，對(duì)脆性破壞的抗力也極大。② 韌性高，具有優(yōu)良的低溫韌性，因此可在大型焊接結(jié)構(gòu)件和低溫環(huán)境中使用。③ 優(yōu)秀的焊接性能，成分設(shè)計(jì)時(shí)極力減低碳含量、碳當(dāng)量和熱敏感系數(shù)，以提高焊接性能，因而具有優(yōu)秀的焊接接頭性能。④ 優(yōu)秀的加工性能，鋼板可進(jìn)行冷加工、彎曲加工和切斷加工。氣體切斷時(shí)，即使不預(yù)熱也不會(huì)出現(xiàn)裂縫。進(jìn)行預(yù)熱加工時(shí)，調(diào)質(zhì)鋼需在回火溫度以下加工。⑤ 高超的耐磨損、耐腐蝕性，由于含有鉬、鉻等合金元素，與一般鋼材比較，耐腐蝕性良好，硬度也比較高，耐磨損性也良好。

1.6.2 PCR反應(yīng)體系與循環(huán)條件PCR擴(kuò)增體系：mix 12.5 μL，10 μmo1·L-1的上、下游引物各1 μL，上述制備的DNA模板2.5 μL，無(wú)菌去離子水8 μL，總體積25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火溫度依照各引物(表1)設(shè)定并持續(xù)60 s，隨后72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。

1.6.3 瓊脂糖凝膠電泳1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳槽中加入0.5×Tris-硼酸電泳緩沖液，電壓100 V，約30 min后取出成像拍照，保存圖片。

1.7 消毒劑耐藥基因與MIC值相關(guān)性分析

采用SAS 9.4分析消毒劑耐藥基因與MIC值之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離情況

大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，邊緣整齊，表面光滑，在EMB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為光滑圓形，有紫色或黑色中心，有金屬光澤的菌落特征。74個(gè)牛奶樣品共檢測(cè)出45株疑似大腸桿菌，16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI上的BLAST進(jìn)行序列比對(duì)后，最終確認(rèn)全部為大腸桿菌。該批牛奶樣品中大腸桿菌的檢出率為60.81%(45/74)。

2.2 消毒劑MIC值測(cè)定結(jié)果

4種消毒劑對(duì)45株牛奶源大腸桿菌的MIC值不同，范圍廣泛：CTAB、BC、CPC和DDAC對(duì)質(zhì)控菌株ATCC 10536的MIC值分別為128 mg·L-1、16 mg·L-1、64 mg·L-1、4 mg·L-1(表2)。45株大腸桿菌中，CTAB的MIC值為128～512 mg·L-1，其中MIC值為256 mg·L-1的共34株(75.56%)；BC的MIC值為32～256 mg·L-1，其中MIC值為128 mg·L-1的共32株(71.11%)；CPC的MIC值為32～256 mg·L-1，其中MIC值為128 mg·L-1的共18株(40.00%)；DDAC的MIC值為16～128 mg·L-1，其中MIC值為32 mg·L-1的共35株(77.78%)。本次檢測(cè)中，45株牛奶源大腸桿菌對(duì)CTAB、BC及CPC的抑制50%受試菌生長(zhǎng)所需MIC值(MIC50)和抑制90%受試菌生長(zhǎng)所需MIC值(MIC90)均達(dá)到128 mg·L-1以上，且對(duì)DDAC更敏感，其MIC50和MIC90分別達(dá)到32 mg·L-1和64 mg·L-1(表3)。

2.3 消毒劑耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 消毒劑耐藥基因檢出率45株牛奶源大腸桿菌中全部檢出攜帶消毒劑耐藥基因，染色體型耐藥基因檢出率(37.78%～84.44%)均高于質(zhì)粒型耐藥基因(4.44%～33.33%)。其中，基因ydgF(n=38，84.44%)和ydgE(n=36，80.00%)的檢出率最高，基因sugE(p)(n=2，4.44%)、qacG(n=5，11.11%)和qacF(n=6，13.33%)的檢出率較低(圖1)。

表2 大腸桿菌對(duì)不同消毒劑的最低抑菌濃度值分布Table 2 Minimum inhibitory concentrations of quaternary ammonium compounds disinfectants on Escherichia coli

表3 大腸桿菌對(duì)4種季銨鹽類消毒劑的耐受程度Table 3 The tolerance of Escherichia coli to 4 quaternary ammonium compounds disinfectants

圖1 45株大腸桿菌消毒劑耐藥基因檢測(cè)Fig.1 Detection of disinfectant resistant genes in 45 Escherichia coli isolates

2.3.2 消毒劑耐藥基因組合根據(jù)大腸桿菌攜帶消毒劑耐藥基因的不同，將45株大腸桿菌攜帶的消毒劑耐藥基因分為33種不同組合(表4)，耐藥基因組合最少的有1種，最多的共8種，檢測(cè)出3種及3種以上的耐藥基因菌株有37株，占82.22%。檢出耐藥基因組合占比為2.22%～8.89%，其中，檢出耐藥基因菌株數(shù)最多的組合為ydgE-ydgF-sugE(c)(n=4，8.89%)，其次為mdfA-ydgE-ydgF-sugE(c)(n=3，6.67%)和mdfA-ydgE-ydgF-emrE-sugE(c)(n=3，6.67%)。檢出耐藥基因菌株數(shù)最多的組合中的4種菌株對(duì)5種消毒劑的MIC值均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，并顯示出對(duì)這5種消毒劑為較高水平耐藥。

2.4 消毒劑耐藥基因與MIC值相關(guān)性

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌消毒劑基因qacF與128 mg·L-1的CPC之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；未發(fā)現(xiàn)其他耐藥基因與MIC值之間差異性。但分析消毒劑耐藥基因組合與MIC值之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，耐藥基因組合為5種及5種以上的大腸桿菌中，CTAB的MIC90為512 mg·L-1的菌株占31.25%(5/16)；耐藥基因組合為4種及4種以上的菌株中，CPC的MIC90為256 mg·L-1的菌株占29.63%(8/27)。

表4 45株大腸桿菌中消毒劑耐藥基因分布情況Table 4 Distribution of disinfectant resistant genes in 45 Escherichia coli isolates

3 討論

3.1 牛奶中大腸桿菌污染情況

本研究中45株大腸桿菌均分離于牧場(chǎng)健康奶牛牛奶樣品，分離率為60.81%。Ombarak等(2016)調(diào)查埃及被大腸桿菌污染原料乳及其產(chǎn)品中獲得了222株大腸桿菌，而其他喜食牛奶的國(guó)家也曾不同程度地爆發(fā)過(guò)受致病菌污染而導(dǎo)致的牛奶源疾病(馮疆蓉，李春杰，2016)。付宇等(2016)在采集的110份牛奶樣品中共分離出大腸桿菌59株，檢出率為53.6%(59/110)。黃夢(mèng)夏等(2018)采集牛奶樣本26份，鑒定出大腸桿菌6株，檢出率為23.1%(6/26)。牛春暉等(2018)從采集牛奶樣本中獲得的大腸桿菌分離率高達(dá)100%。一般情況下，牛奶中大腸桿菌主要來(lái)源于患病泌乳牛病原菌的感染，這與奶牛生活環(huán)境及擠奶室環(huán)境有很大關(guān)系(馮疆蓉，2017)。

3.2 牛奶中大腸桿菌對(duì)消毒劑的耐藥性

45株大腸桿菌對(duì)4種消毒劑的MIC值檢測(cè)結(jié)果均不相同，其中，CTAB的MIC值最高(128～512 mg·L-1)，明顯高于其他3種消毒劑，這與Schwaiger等(2014)對(duì)腸球菌Enterococcus的季銨鹽類消毒劑耐藥性研究的結(jié)果一致。目前對(duì)于細(xì)菌對(duì)消毒劑耐藥性的判定依據(jù)尚無(wú)定論。較多研究者以藥物敏感性實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)得的菌株MIC值與所用標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同環(huán)境下的MIC值比較來(lái)判定該菌株的耐藥性(常帥，2013)。某細(xì)菌在消毒劑作用下的MIC值超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)菌株時(shí)，則認(rèn)為該細(xì)菌對(duì)該消毒劑具有耐藥性。本研究中大腸桿菌對(duì)BC和DDAC的MIC值均高于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株，少數(shù)菌株對(duì)CTAB和CPC的MIC值與標(biāo)準(zhǔn)菌株的相同，但多數(shù)菌株對(duì)這2種消毒劑的MIC值仍較高。另外，大腸桿菌對(duì)研究中4種消毒劑的MIC50和MIC90都較高，其中，CTAB、BC和CPC的MIC50和MIC90均在128 mg·L-1以上。由此可見，與抗生素濫用后造成的影響一樣，消毒劑的廣泛使用也會(huì)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生選擇作用，造成大腸桿菌的耐藥性。何雪梅等(2014)對(duì)豬肉源大腸桿菌消毒劑的耐藥性研究表明，大腸桿菌對(duì)QACs消毒劑的MIC值普遍較高，且比標(biāo)準(zhǔn)菌株的有明顯升高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

大腸桿菌消毒劑耐藥性產(chǎn)生的原因主要是消毒劑的使用劑量不足，以及不科學(xué)的使用范圍。大量動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥率與養(yǎng)殖場(chǎng)抗菌藥的使用劑量、頻率存在很強(qiáng)的相關(guān)性(潘志明等，2002；宋立等，2009)。不合理的操作使消毒劑對(duì)其原本可以殺滅的細(xì)菌不能起到殺滅作用，當(dāng)長(zhǎng)期處于這種無(wú)效藥物作用的環(huán)境下，便強(qiáng)化了細(xì)菌對(duì)該類藥物的適應(yīng)性，從而增加了消毒劑耐藥性的產(chǎn)生概率。

3.3 牛奶中大腸桿菌消毒劑耐藥基因情況

本研究的消毒劑抗性基因包括mdfA、ydgE/F、emrE和sugE(c)5種染色體編碼基因，以及qacE、qacF、qacEΔ1、qacG和sugE(p)5種質(zhì)粒介導(dǎo)的抗性基因。這些染色體編碼基因能特異性地介導(dǎo)對(duì)QACs消毒劑的耐藥性，且研究表明它們可以在大腸桿菌中垂直傳播(Bay &Turner，2009)。同樣，當(dāng)環(huán)境中擁有質(zhì)粒、整合子或者轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)元件介導(dǎo)的抗性基因，如qacE、qacEΔ1等，細(xì)菌就有可能通過(guò)可移動(dòng)元件獲得這些抗性基因，從而增加該環(huán)境中細(xì)菌消毒劑抗性基因的攜帶率。目前已有報(bào)道的消毒劑抗性基因除上述10種外，還有很多屬于qac家族亞型的基因，比如qacA、qacB、qacC、qacH和qacI等，其中已有研究在大腸桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)qacH、qacI基因(Polyetal.，1998；Kuckenetal.，2000；Lietal.，2010)。這些抗性基因中只有mdfA基因?qū)儆贛FS家族，其余基因均通過(guò)編碼外排泵蛋白賦予對(duì)QACs消毒劑的耐藥性，因而均在SMR蛋白家族中(Bayetal.，2008)。趙凱麗和李武平(2016)在研究微生物消毒劑抗性產(chǎn)生機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可以利用外排泵增加消毒劑向胞外的主動(dòng)排出從而對(duì)消毒劑產(chǎn)生抗性，對(duì)大腸桿菌所含抗性基因進(jìn)行檢測(cè)顯示，無(wú)論是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽(yáng)性菌中均有外排泵基因檢出的情況。Smith等(2008)發(fā)現(xiàn)，qac家族基因檢出的陽(yáng)性菌株與陰性菌株對(duì)QACs消毒劑的MICs存在顯著差異，其中攜帶qac家族基因菌株的MIC值可為不攜帶該家族基因的2倍。

本研究所檢測(cè)的10種消毒劑抗性基因均為陽(yáng)性，消毒劑染色體型耐藥基因檢出率(37.78%～84.44%)較質(zhì)粒型耐藥基因檢出率(4.44%～33.33%)高，基因ydgF(n=38，84.44%)和ydgE(n=36，80.00%)最高。同時(shí)，質(zhì)粒型耐藥基因中檢出率最高的是qacEΔ1(n=15，33.33%)，其次是qacE(n=8，17.78%)。qacEΔ1基因?yàn)閝acE基因的缺失型，本研究中牛奶源大腸桿菌中qacEΔ1基因檢出率較其他質(zhì)粒型基因高。宋紅梅等(2013)對(duì)生活用水中總大腸菌群中耐藥基因研究中，大腸桿菌qacEΔ1基因檢出率(45.5%)也較高。由此可見，qacEΔ1基因很可能在細(xì)菌之間廣泛傳播，應(yīng)當(dāng)引起重視。

本研究所檢測(cè)的耐藥基因在45株牛奶源大腸桿菌中均被檢出，且耐藥基因組合較豐富(共檢出33種)，且檢測(cè)基因組合越多，菌株的MIC值越高。說(shuō)明牛奶源大腸桿菌攜帶消毒劑抗性基因的概率很高。嚴(yán)重的是，某些細(xì)菌由于長(zhǎng)期暴露在QACs消毒劑亞抑菌濃度下，不僅產(chǎn)生對(duì)消毒劑的耐藥性，還可能出現(xiàn)傳播時(shí)交叉耐藥現(xiàn)象，比如可能導(dǎo)致消毒劑與抗生素產(chǎn)生共耐藥機(jī)制(Soumetetal.，2012；楊盛智等，2016)，給臨床疾病治療上抗生素的使用帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)。