青稞根際優(yōu)良聯(lián)合固氮菌的篩選及鑒定

何建清，張格杰，趙偉進，王孝先

(西藏農(nóng)牧學(xué)院生物技術(shù)中心，西藏 林芝 860000)

青稞(HordeumvulgareLinn． var．nudumHook．f．)起源于西藏，是藏族人民的主糧[1]。青稞富含多種氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分，集保健和營養(yǎng)于一身。近年來，隨著消費觀念的轉(zhuǎn)變，青稞這種天然綠色谷物越來越受大眾青睞[2]。2010年西藏青稞種植面積19.74萬～21.3萬hm2，總產(chǎn)量61.2萬～63.6萬t，占整個糧食總播面積的66.9%和總產(chǎn)的64.7%，其栽培措施受到了廣泛的關(guān)注。提高青稞產(chǎn)量的關(guān)鍵肥料為氮肥[3]。然而，50%以上氮肥由于揮發(fā)作用、脫氮作用和淋失，造成嚴重的能源浪費和環(huán)境問題[4]。為避免造成環(huán)境污染，施用生物菌肥是首選[5]。

聯(lián)合固氮是自由生活的固氮菌定殖于植物根表、近根土壤或部分侵入植物根皮層組織或維管中形成的特殊固氮作用[6]。研究表明，聯(lián)合固氮菌廣泛存在于非豆科植物的根際、根表和根皮層中[7]。聯(lián)合固氮菌除了能為宿主提供氮素以外，還同時具有溶磷、分泌生長素、增強植株抗病性、抗逆境等多方面的促進植物生長的作用[8]。用這類菌研制的生物肥料具有成本低、持續(xù)效果好、增產(chǎn)穩(wěn)定、非再生能源消耗少及對環(huán)境、食品安全等特點。同時，可以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機質(zhì)含量，改良鹽堿地，保障農(nóng)牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[9]。近年來，人們對非豆科植物與根系聯(lián)合的特殊固氮菌展開了廣泛研究。禾本科作物是對氮肥最具依賴性的作物，利用聯(lián)合固氮細菌在禾本科植物根部的固氮作用，在一定程度上可減少化學(xué)肥料的使用。至今報道具聯(lián)合固氮能力的禾本科植物至少有40屬100種[10]，前人對水稻、小麥、玉米、燕麥、高粱和甘蔗等禾本科植物根際聯(lián)合固氮菌的促生效應(yīng)進行了較深入研究。張堃等[11]從燕麥和鹽堿地小麥根際篩選的優(yōu)良聯(lián)合固氮菌對青稞主根長度(乳熟期)、地下生物量(完熟期)、粗蛋白含量(抽穗期、灌漿期和乳熟期)、子粒產(chǎn)量均有顯著的促進作用。但不同生境和植物，固氮菌的種類和特性不同，因此，從特定生境和植物根際分離獲得高效固氮菌株以研制適合不同生境和植物的專用生物菌肥具有十分重要的意義。西藏青稞主產(chǎn)區(qū)90%以上為干旱和半干旱地，土壤保水、保肥能力差，化肥利用率很低。因此，充分發(fā)揮青稞地生態(tài)系統(tǒng)中聯(lián)合固氮菌的固氮促生潛力，對提高西藏青稞的生產(chǎn)能力，保護和改善青稞的生態(tài)環(huán)境，促進西藏青稞產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的經(jīng)濟和社會意義。本研究旨在從西藏不同地區(qū)青稞根際分離篩選具有促生作用的聯(lián)合固氮菌，為利用生物固氮在青稞生產(chǎn)上實現(xiàn)節(jié)肥減耗、加強青稞生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根際土樣的采集 于2018 年4—6月采集西藏林芝、米林、朗縣、山南、拉薩、日喀則等地青稞的根系土壤25份，采集根際土樣時先去除表層的落葉及枯草，將整個植株帶根系小心挖出，輕輕抖落根系上的大塊土壤，用刮刀輕輕刮下黏附于根系表面約2 mm土壤，分別將采集到的根際土樣裝入無菌紙袋，并在袋上標注，帶回實驗室立即處理。

1.1.2 培養(yǎng)基 本文所用的Ashby無氮培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基參考相關(guān)文獻[12]配制。

1.1.3 青稞種子 本文所用的青稞種子為隆子縣六棱黑青稞。

1.2 方法

1.2.1 根際聯(lián)合固氮菌株的分離 采用稀釋平板分離法。稱取附著于青稞根上的土10 g放入90 mL無菌水中，28℃恒溫、超聲器超聲10 min分散微生物細胞，靜置10 min，即得10-1稀釋液，各取100 μL涂在Ashby平板上，在28℃培養(yǎng)5～7 d至長出單菌落。用接種環(huán)挑取不同單菌落，在Ashby平板上劃線純化3次得到單一菌落。將純化后的單菌落接種于LB平板上，4℃存放，備用；另取純化的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取一定量的菌液與甘油混合，-80℃冰箱長期保存。

1.2.2 菌株固氮能力的測定 采用微量凱氏定氮法測定菌株的固氮量[13]。菌株活化后在Ashby無氮液體培養(yǎng)基上生長，每個菌株取1 mL菌液加入裝有50 mL Ashby無氮液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28℃，180 r·min-1搖床上培養(yǎng)10 d，Ashby無氮培養(yǎng)液作為對照。培養(yǎng)結(jié)束后，12 000 r·min-1離心30 min，上清液利用微量凱氏定氮法測定各處理的氮含量。含氮量根據(jù)以下公式進行計算：

氮含量(mg·L-1)=[(V1-V2)×14×1000]/V

式中，V1為樣品滴定時用去的標準鹽酸溶液體積(mL)；V2為空白滴定時用去的標準鹽酸溶液體積(mL)；14為每毫摩爾氮的毫克數(shù)；V為菌株取液量(mL)。

1.2.3 固氮菌浸種 選擇固定氮量較強菌株進行種子萌發(fā)和幼苗生長試驗。在30℃條件下，將固氮菌株振蕩培養(yǎng)7 d備用。選取千粒重為40～50 g，外觀豐滿的同一批青稞種子。首先用75%乙醇消毒20 s，然后用10% NaClO浸泡10 min，浸泡后立即用無菌水沖洗4～6遍。將消毒的青稞種子分別浸入菌液中，25℃吸附1 h，于無菌操作臺上風(fēng)干后，轉(zhuǎn)置于墊有潤濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿50粒，25℃黑暗培養(yǎng)7 d。以不接菌的培養(yǎng)液做對照。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)文獻[14]計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)。用直尺量取各幼苗莖粗、株高、根長，計數(shù)側(cè)根數(shù)。

1.2.4 固氮菌株生理生化和細胞形態(tài)特征測定 按照東秀珠方法[15]，對篩選的聯(lián)合固氮菌株進行生理生化特性分析，菌體特征包括革蘭氏染色、芽孢染色和菌體大小等指標的測定。

1.2.5 16S rDNA序列測定與系統(tǒng)學(xué)分析 培養(yǎng)固氮菌，提取細胞總DNA作為基因擴增模板。利用細菌16S 通用引物27f: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r: 5-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴增細菌的 16S rRNA 基因[16]。PCR 擴增產(chǎn)物進行 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產(chǎn)物回收和純化直接送測序公司測序，序列拼接及相似性分析使用系統(tǒng)進化分析采用軟件MEGA5.1 鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹?；虮葘νㄟ^美國國家生物技術(shù)信息中心 NCBI 數(shù)據(jù)庫( http: //www . ncbi. nlm. nih . gov) 在線完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離與純化結(jié)果

采用無氮Ashby平板表面涂抹法進行聯(lián)合固氮菌的分離，每份樣品3個重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，挑選菌落光滑、大且粘稠的菌株接種到 LB平板上進行純化，結(jié)果表明，從25份青稞根須樣品中經(jīng)反復(fù)分離純化出72株聯(lián)合固氮菌。

2.2 菌株固氮能力的測定

利用微量凱氏定氮法測定固氮菌株的固定氮量，發(fā)現(xiàn)菌株間的固氮能力存在顯著差異。和CK相比，72株菌的氮增量為0.33～26.07 mg·L-1。其中10個菌株表現(xiàn)較強的固氮能力(表 1)，培養(yǎng)7 d氮增量為17.01～26.07 mg·L-1。菌株24-2的固氮量最高，氮增量為26.07 mg·L-1，其次為菌株23-3，氮增量為23.05 mg·L-1，位于第三的是菌株21-1、35-2和40-4，氮增量分別為21.58、21.44 mg·L-1和21.51 mg·L-1，其余菌株的氮增量均在17 mg·L-1以上。

表1 部分聯(lián)合固氮菌株的氮增量

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同。

Notes: Different lowercase letters mean significant difference between treatments (P<0.05), the same below.

2.3 聯(lián)合固氮菌對青稞種子萌發(fā)和幼苗的影響

2.3.1 聯(lián)合固氮菌對青稞種子萌發(fā)的影響 選擇表1中10株菌進行種子萌發(fā)試驗(表2)，結(jié)果表明：各供試固氮菌株對青稞種子發(fā)芽率影響不同，和CK相比，10株菌的發(fā)芽率增加幅度為-7.14%～25.00%。大多數(shù)菌株 (如 20-2、 24-2、26-1、35-2和 40-4等 )對青稞種子萌發(fā)有明顯促進作用，其中菌株20-2的效果最好，萌發(fā)率達87.50%，較CK提高了25.00%，其次是菌株26-1和40-4，萌發(fā)率均為85.0%，和CK相比，發(fā)芽率提高了21.43%。發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率趨勢一致。

2.3.2 聯(lián)合固氮菌對青稞幼苗生長的影響 接種固氮菌對青稞幼苗生長影響測定結(jié)果 (表 3)表明：供試菌株對青稞莖粗均有促進作用，且差異顯著(P<0.05)。效果最好的是菌株23-2，和CK相比，莖粗增加了18.32%；大部分菌株(21-1、23-2、23-3、35-2、39-5)對青稞株高生長有明顯的促進作用，最高者達12.88 cm，比對照增加了7.60%；供試菌株均可促進青稞根長生長，最高者達10.37 cm，比對照增加了52.50%；菌株中除22-5和40-4外，均可促進須根數(shù)的增加。

表2 聯(lián)合固氮菌浸種對青稞種子萌發(fā)的影響

表3 聯(lián)合固氮菌浸種對青稞幼苗生長的影響

2.4 聯(lián)合固氮菌對青稞幼苗生物量的影響

由表4可知，與CK相比，菌株20-2、21-1、22-5、23-3、26-1、35-2可顯著增加青稞的鮮重和根重，分別較CK增加20.44%和37.89%、8.56%和14.54%、57.73%和74.90%、110.50%和137.44%、39.78%和59.91%、22.93%和44.93%；菌株21-1、22-5、23-3、26-1和40-4能顯著增加芽的重量，與CK相比，分別增加了1.50%、34.59%、67.67%、11.28%和15.04%。與CK相比，只有菌株23-3能顯著增加青稞幼苗干重。

2.5 固氮菌株的形態(tài)及生理生化特征

綜合表1、2、3、4結(jié)果，選取6株綜合性能較好的固氮菌進行形態(tài)觀察和生理生化特征測試(表5)，測試結(jié)果表明，6個菌株均為桿狀細菌，除菌株22-5為芽孢細菌和革蘭氏陽性菌(G+)外，其余5株菌均為不產(chǎn)芽孢，革蘭氏陰性菌(G-)。理化特性試驗結(jié)果表明，6 株菌對接觸酶反應(yīng)、V-P 試驗、D-葡萄糖產(chǎn)酸反應(yīng)和D-甘露醇反應(yīng)結(jié)果均為陽性；氧化酶反應(yīng)、明膠液化、產(chǎn)H2S和淀粉水解反應(yīng)均為陰性；牛奶胨化和硝酸還原酶只有菌株20-2反應(yīng)陽性。

2.6 固氮菌株的 16S rDNA 基因 PCR 擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

獲得6株菌的16S rDNA序列，片段大小均位于1 500 bp左右。在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索與其具有較高相似性的參比菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育圖譜(圖1)。結(jié)合細菌的生理生化特征(見表5)，確定本研究分離篩選出的固氮菌為：菌株35-2和39-5屬于根瘤菌屬Rhizobium、菌株22-5屬于類芽孢桿菌屬Paenibacillus、菌株23-3屬于無色桿菌屬Achromobacter、菌株20-2和26-1屬于假單胞菌屬Pseudomonas。

表4 聯(lián)合固氮菌對青稞幼苗生物量的影響/(g·10株-1)

表5 6株篩選菌株的理化特性

注: “+”表示生化反應(yīng)或革蘭氏染色為陽性；“-”表示生化反應(yīng)或革蘭氏染色為陰性。

Notes: “+” denotes positive biochemical reaction (or gram stain); “-” denotes negative biochemical reaction (or gram stain).

圖1 聯(lián)合固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育圖譜Fig.1 Dendrogram showing the phylogenetic position of the associative nitrogen-fixing bacteria

3 討論與結(jié)論

從鑒定結(jié)果看，西藏高寒地區(qū)青稞根際固氮菌類群有根瘤菌屬Rhizobium、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、無色桿菌屬Achromobacter和假單胞菌屬Pseudomonas4個屬，其優(yōu)勢種群為根瘤菌屬Rhizobium和假單胞菌屬Pseudomonas。相對于其他生境和植物，該地區(qū)青稞根際固氮菌的種類較為單一，這可能與植物種類及其生存環(huán)境有關(guān)，與采樣時間、樣品保存時間與方式及所用培養(yǎng)基種類等也有關(guān)[17]。此外，本研究中從青稞根際分離到了固氮根瘤菌。研究表明，根瘤菌不但可以與豆科植物共生，而且可以在土壤中長期以腐生菌的狀態(tài)存在[18]。大量研究已經(jīng)證實，根瘤菌可以作為植物根際促生菌，對禾本科等植物產(chǎn)生促生作用[19]。這種促生作用的形成，可以通過在非豆科植物根圈定殖或者作為內(nèi)生菌在根內(nèi)定殖。該領(lǐng)域的拓展，顯著擴大了根瘤菌的作用范圍，對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。

在聯(lián)合固氮研究中，菌株對宿主植物生長的影響及其固氮量是研究者們關(guān)注的核心問題。乙炔還原法( ARA)雖可通過對固氮酶活性測定來確認聯(lián)合固氮作用存在與否及固氮酶活性強弱，但不能直接而準確獲得固氮量，因此，很少用于固氮量計算[20]。目前在固氮研究中，最經(jīng)典的測定技術(shù)是凱氏定氮法[21]。本研究用凱氏定氮法篩選出了6株具有較好促進青稞種子萌發(fā)和幼苗生長的菌株，關(guān)于這些菌株對青稞生長的大田促生效能、生態(tài)安全性以及最佳發(fā)酵條件等有待進一步研究。

本研究從西藏高寒地區(qū)青稞根際分離獲得的72株聯(lián)合固氮菌，氮增量為0.30～26.07 mg·L-1，其中有10個菌株的氮增量達17.0 mg·L-1以上，尤以菌株24-2的氮增量最高，為26.07 mg·L-1，其次為菌株23-3，氮增量為23.05 mg·L-1，位于第三的是菌株21-1、35-2和40-4，氮增量分別為21.58、21.44 mg·L-1和21.51 mg·L-1。通過菌株對青稞種子萌發(fā)率、莖粗、株高、根長、須根數(shù)和生物量等促生性看，菌株20-2、22-5、23-3、26-1、35-2和39-5等均表現(xiàn)出良好的促生效應(yīng)，其中菌株20-2能顯著提高青稞的發(fā)芽率，較CK 提高了25.00%，菌株23-3能顯著增加青稞的莖粗、株高、根長、須根數(shù)和生物量，較CK提高了13.74%、3.17%、33.97%、1.31%和110.50%，將這兩株菌進行組合，有望研制出優(yōu)良的青稞復(fù)合固氮菌肥。