復(fù)方鉤藤降壓片干預(yù)高血壓左心室肥厚血漿代謝組學(xué)的通路分析

馮 宇 俞赟豐 周曼麗 王健章 張家齊 錢舒樂 簡維雄

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410208

復(fù)方鉤藤降壓片主要由鉤藤、麥冬、川芎等中藥組成。近年來，通過對復(fù)方鉤藤降壓片進行臨床及實驗研究[1-2]，證實其可抑制機體炎癥狀態(tài)，為其降壓機制提供了新依據(jù)。

本研究前期運用代謝組學(xué)技術(shù)[3]試從小分子代謝產(chǎn)物層面闡釋其作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有11 種代謝產(chǎn)物與復(fù)方鉤藤降壓片組相關(guān)：胞嘧啶核苷酸、腐胺、來蘇糖酸、二十四烷酸、甘油酸、肌醇、肌苷、山梨糖醇、木糖醇、核糖、乳酸。為從代謝途徑水平了解細胞或組織的生物學(xué)意義[4]，故進行下一步的KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）、HMDB（the hu man metabolome database）、MetaboAnalyst 數(shù)據(jù)庫等信息分析。具體內(nèi)容如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級12 周齡自發(fā)性高血壓大鼠16 只，雄性，180～220 g。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格許可編號：20141020，飼料購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心。

1.2 代謝譜來源

本研究前期實驗[3]顯示，復(fù)方鉤藤降壓片組和替米沙坦組的血漿代謝產(chǎn)物通過模式識別：復(fù)方鉤藤降壓片組與腐胺、胞嘧啶核苷酸、甘油酸、來蘇糖酸、二十四烷酸、肌醇、肌苷、木糖醇、山梨糖醇、核糖、乳酸有關(guān)。

1.3 分析軟件

通路分析采用KEGG（http：//www.genome.Jp/kegg/）、MetaboAnalyst 網(wǎng)絡(luò)軟件（http：//www.metaboanalyst.ca）分析代謝產(chǎn)物相關(guān)的酶、轉(zhuǎn)運蛋白和相關(guān)性質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組產(chǎn)物檢索匹配情況

有11 種代謝產(chǎn)物與復(fù)方鉤藤降壓片組有關(guān)，將其在KEGG 和HMDB 中進行檢索，相應(yīng)的ID 號。見表1。

2.2 代謝產(chǎn)物路徑分析

MetaboAnalyst 分析后，生物代謝通路顯示，11 種代謝產(chǎn)物參與14 條代謝路徑，通路見表2、圖1。通過拓撲分析計算表中代謝通路的影響，選出P＜0.05 的2 條代謝路徑（磷酸戊糖路徑和嘌呤代謝）。圖2～4 顯示了具有較高影響值的2 條通路的詳細結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其內(nèi)源性代謝物在實驗過程中有明顯波動，對左心室肥大有顯著影響。

表1 高血壓左心室肥大血漿代謝組產(chǎn)物基本注釋表

表2 通過MetPA 得到的獨特的通路分析結(jié)果

2.2.1 磷酸戊糖途徑 經(jīng)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶氧化后葡萄糖-6-磷酸形成6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯，6-磷酸葡糖酸通過6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶氧化脫羧形成核酮糖-5-磷酸。核酮糖-5-磷酸通過核酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶或核酮糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶分別生成核糖-5-磷酸或木酮糖-5-磷酸。核糖-5-磷酸通過核糖磷酸焦磷酸激酶產(chǎn)生核糖磷酸焦磷酸。7-磷酸在轉(zhuǎn)酮醇酶作用下生成核糖-5-磷酸。木酮糖-5-磷酸通過轉(zhuǎn)酮醇酶生成景天庚酮糖-7-磷酸和甘油醛-3-磷酸。甘油醛在乙醛脫氫酶作用下生成甘油酸，再在甘油2-激酶催化下產(chǎn)生2-磷酸甘油酯。見圖2。

2.2.2 嘌呤代謝 核糖-5-磷酸通過葡萄糖磷酸變位酶2的作用轉(zhuǎn)化為核糖-1-磷酸。磷酸戊糖焦磷酸激酶催化核糖-5-磷酸生成5-磷酸核糖-α-焦磷酸（PRPP）。5-磷酸核糖-1-焦磷酸在磷酸核苷酸胺轉(zhuǎn)移酶的作用下產(chǎn)生5-磷伯胺。見圖3。

2.2.3 嘌呤代謝 肌苷二磷酸通過外核苷三磷酸雙氫化酶產(chǎn)生肌苷。肌醇5’-四磷酸在酶的作用下產(chǎn)生肌苷。肌苷在三磷酸肌苷焦磷酸酶的作用下產(chǎn)生次黃嘌呤核苷酸（IMP）。見圖4。

3 討論

左心室肥厚（LVH）通常表現(xiàn)為室壁增厚、心肌重塑和心肌重量增加，是機體對長期增加的血液流動學(xué)負荷的一種適應(yīng)性改變[5]。在復(fù)方鉤藤降壓片干預(yù)的動態(tài)過程中，11 種代謝產(chǎn)物對應(yīng)于KEGG 中的共有14 條通路，其中2 條顯著富集，3 種蛋白質(zhì)（核糖-5-磷酸、甘油酸、肌苷）參與了重要通路。

圖1 用MetPA 分析得到的通路分析概要圖

圖2 Pentose phosphate pathway 代謝通路的結(jié)構(gòu)

圖3 Purine metabolism 代謝通路的結(jié)構(gòu)局部放大圖

圖4 Purine metabolism 代謝通路的結(jié)構(gòu)局部放大圖

磷酸戊糖路徑（Pentose phosphate pathway，PPP）是細胞內(nèi)葡萄糖的代謝路徑之一，是DNA 和RNA 在體內(nèi)合成戊糖的唯一來源[6-7]。有研究[8]表明，內(nèi)皮中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺失會降低一氧化氮利用率以致內(nèi)皮功能障礙。內(nèi)皮功能障礙時，收縮因子與內(nèi)皮舒張失衡，影響內(nèi)皮素-1，它可通過各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生成纖維細胞，促進心肌肥厚及心肌纖維化[9-10]。實驗[11]證明NADPH 的減少會引起氧化應(yīng)激，并損傷脂肪與蛋白質(zhì)。其中氧化應(yīng)激在研究中顯示參與了心肌重構(gòu)生理病理過程[12]。川芎中主成分川芎嗪能改善炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激[13]，由此川芎可能干預(yù)此代謝通路阻止心肌重構(gòu)發(fā)生。

在磷酸戊糖路徑（pentose phosphate pathway，PPP）中有核糖-5-磷酸（C00117）和甘油酸（C00258）參與。甘油醛在乙醛脫氫酶作用下生成甘油酸，其中在心肌梗死、缺血灌注等心肌損傷過程中乙醛脫氫酶可起到保護心肌的作用[3]。核糖-5-磷酸可用于核酸的生物合成。當(dāng)心肌細胞脫氧核糖核酸與核糖核酸合成過多時，會使心肌細胞體積增大及肥厚引起左心室肥厚[14]。鉤藤中有效成分鉤藤堿能抑制血管平滑肌增殖、降低平滑肌張力[15]，改善心室結(jié)構(gòu)。鉤藤可能在代謝通路中起作用，影響心室結(jié)構(gòu)。

用于心肌嘌呤補救合成途徑的前體物質(zhì)包括腺苷和肌苷。腺苷可通過腺苷激酶途徑合成ATP，以增加缺血心肌能量的保存。肌酐參與腺苷脫氨酶-嘌呤核苷磷酸化酶-磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化為AMP，磷酸化的AMP 合成ATP 以增加心肌能量的物質(zhì)儲存[16]。肌苷可抑制磷酸核糖焦磷酸（PRPP）在體內(nèi)的活化，從而改善心肌的能量狀態(tài)，氧化導(dǎo)致的細胞損傷也可以得到緩解[17]。腺苷可從抑制ROS 的生成與中性粒細胞的活化、抗炎作用等多個方面進行心肌的保護[18]。麥冬也可減輕炎性反應(yīng)[19-20]，促進心肌保護。

在嘌呤代謝通路中有肌苷（C00081）和核糖-5-磷酸（C00117）參與。肌苷可通過抑制核蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶阻止一氧化氮化酶，使一氧化氮（NO）的合成降低，保護細胞的膜性結(jié)構(gòu)[21-22]。在心血管系統(tǒng)中，NO 的生物效應(yīng)降低由自由基不平衡而引起，從而引起心肌纖維化與心肌細胞肥大等現(xiàn)象。在體內(nèi)，次黃嘌呤核苷酸可產(chǎn)生類似于NO 供體的生物效應(yīng)，以改善受損血管內(nèi)皮的功能，提高心肌收縮力[23]。鉤藤中主要成分異鉤藤堿可有效抑制NO 釋放[24]，麥冬有效成分可保護血管內(nèi)皮細胞[25]，都能促進膜性結(jié)構(gòu)恢復(fù)。核糖激酶將核糖磷酸化，隨后磷酸化的核糖參與嘌呤代謝，核糖水平降低，可能與膜體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)引起腺苷酸激酶活性增加相關(guān)[26]。

通過通路分析構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)該藥物可能對通路中某些代謝產(chǎn)物或酶等進行特異性干預(yù)，從而恢復(fù)正常細胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)脂肪酸代謝等。且實驗研究[1，7]復(fù)方鉤藤降壓片相對于西藥，降壓效果更明顯。而復(fù)方鉤藤降壓片在干預(yù)左心室肥厚過程中，對通路中某些血漿代謝產(chǎn)物的作用仍需要通過實驗進一步生物學(xué)驗證。