不同方法提取陳皮中黃酮類有效成分含量比較

張婷婷 ，梁 燕 ，彭 燦 ，3△

（1. 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，安徽 合肥 230031； 2. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012； 3. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院中藥復(fù)方安徽省重點實驗室·安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012）

陳皮為蕓香科植物橘 Citrus reticulata Blanco 及其栽培變種的干燥成熟果皮，味苦、辛，性溫，歸肺、脾經(jīng)，用于脘腹脹滿，食少吐瀉，咳嗽痰多［1］。陳皮在我國分布廣泛，來源眾多，主要藥理作用有抗氧化［2］、抗炎［3］、抗心腦血管疾?。?］、抗癌［5］、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［6］等，主要化學成分為黃酮類［7］、揮發(fā)油類［8］、生物堿類成分及微量元素等。黃酮類化合物是陳皮中的主要活性成分，橙皮苷為陳皮中含量最高的黃酮類物質(zhì)。陳皮中其余黃酮類物質(zhì)有新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、桔皮素、川陳皮素等［9］。目前，陳皮的主要提取方法有 2015 年版《中國藥典（四部）》中收錄的索氏提取與加熱回流結(jié)合的方法和超聲提取法。本研究中在橙皮苷的基礎(chǔ)上增加了桔皮素和川陳皮素多甲氧基黃酮類成分作為測定指標［10］，比較2 種提取方法提取陳皮中黃酮類成分的差異，為陳皮的有效成分提取和質(zhì)量控制提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；ST－528 型超微粉碎機（瑞安市賽特機電有限公司）；YL－060S 型超聲波清洗機（深圳市語路清洗設(shè)備有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；SHZ －D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；DF－101S 型集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；JY502 型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司，精度為標準度三級）；BT25S 型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

超純水（自制）；甲醇、乙腈均為色譜純，購自河北百靈威超精細材料有限公司；石油醚（分析純，無錫市佳妮化工有限公司）；冰醋酸（分析純，太倉市周氏化學品有限公司，批號為20180810JN）；橙皮苷標準品（批號為CHB－C－034，質(zhì)量分數(shù)＞98%），川陳皮素標準品（批號為CHB－C－047，質(zhì)量分數(shù)＞98%），桔皮素標準品（批號為CHB－J－046，質(zhì)量分數(shù)＞98%），均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；陳皮藥材產(chǎn)地分別為湖南省懷化市、湖北省宜昌市、山東省臨沂市、浙江省麗水市、湖南省常德市，編號分別為 01，02，03，04，05。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－2% 醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～14 min 時 85%B→67.5%B，14 ～20 min 時 67.5%B→43%B，20 ～ 25 min 時 43%B →33%B，25 ～ 30 min 時33%B→85%B）；流速：1 mL ／min；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL；檢測波長：283 nm。在此色譜條件下，供試品溶液Ⅰ（索氏提取法）、供試品溶液Ⅱ（超聲提取法）色譜圖中，與混合標準品溶液色譜圖中相同保留時間有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1. hesperidin 2.nobiletin 3. tangeretinA.Mixed standard solution B.Test solution Ⅰ（Soxhlet extraction method） C.Test solution Ⅱ （ultrasonic extraction method） D.Methanol blank solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

供試品溶液：每個批次（共5 組）分別取100 g 陳皮藥材，打粉，得粗粉，過3 號篩，備用。分別取各組粗粉1.000 0 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（60 ～90 ℃）80 mL，加熱回流 2 ～ 3 h，棄去石油醚，藥渣揮干，加甲醇80 mL，加熱回流至提取液無色，放冷，濾過，濾液置100mL 容量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器，洗液倒入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液Ⅰ（索氏提取法）。分別取1.000 0 g 各組粗粉，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入50 mL 甲醇，混勻，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾，留取濾液，即得供試品溶液Ⅱ（超聲提取法）。

混合標準品溶液：分別取10.00 mg 橙皮苷、川陳皮素、桔皮素標準品，精密稱定，加入10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，即得。

2.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：取2.2 項下混合標準品溶液1 mL，用甲醇分別稀釋，配制成6 個質(zhì)量濃度水平的待測樣品溶液，其中橙皮苷標準品的質(zhì)量濃度分別為1 000.0，500.0，100.0，50.0，25.0，12.5 μg／mL；川陳皮素和桔皮素的質(zhì)量濃度均為 500，100，50，25，10，5 μg／mL，按2.1 項下色譜條件進樣分析，重復(fù)3 次，以樣品的質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、平均峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n ＝3）Tab.1 Results of linear relation test（n ＝ 3）

精密度試驗：取橙皮苷、川陳皮素、桔皮素質(zhì)量濃度均為 100 μg ／mL 的對照品溶液，按 2.1 項下色譜條件每個樣品日內(nèi)連續(xù)進樣6 次，連續(xù)考察3 d，記錄峰面積，計算平均值。結(jié)果橙皮苷、川陳皮素、桔皮素日內(nèi)及日間測得含量的 RSD 均小于2%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同批次陳皮6 份，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣分析，記錄各組樣品的峰面積，并計算含量。結(jié)果橙皮苷、川陳皮素、桔皮素含量的平均值分別為 4.52%，0.016%，0.012%，RSD 分別為 1.03%，0.97%，1.13%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取陳皮藥材，依法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時按 2.1 項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并計算橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的含量。結(jié)果橙皮苷含量的 RSD 均不超過 2% （ n ＝ 6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

加樣回收試驗：取已知含量的陳皮樣品6 份，每份0.500 0 g，精密稱定，分別加入橙皮苷、川陳皮素、桔皮素對照品粉末 1.190 0，0.161 9，0.108 5 mg，依法提取，得供試品溶液，取適量，按2.1 項下色譜條件進樣檢測，重復(fù)進樣3 次，記錄峰面積，取平均值并計算該條件下的加樣回收率。結(jié)果的 RSD 分別為1.54%，1.96%，1.87% （ n ＝ 3），表明方法回收良好。

2.4 樣品含量測定

取各批次陳皮樣品，依法制備供試品溶液，每批樣品重復(fù)進樣3 次，按2.1 項下色譜條件測定含量，計算峰面積平均值及橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的含量。詳見表2。采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。先進行正態(tài)性檢驗（K－ S 檢驗和 W 檢驗），橙皮苷、川陳皮素和桔皮素含量測定結(jié)果的 W－檢驗和 K－ S 檢驗的 P 值均小于 0.05，故認為不滿足正態(tài)性，故采用非參數(shù)Wilcoxon 檢驗。經(jīng)分析表明，2 種提取方法對陳皮中橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的提取率差異均有統(tǒng)計學意義P 值分別 0.045，0.000 018，0.000 024，每批藥材超聲提取的平均含量均大于索氏提取的平均含量。故認為超聲提取法的提取率高于索氏提取法。

表2 2 種提取方法提取陳皮中黃酮類成分的含量測定結(jié)果（，%，n ＝ 3）Tab.2 Content determination of flavonoids in Pericarpium Citri Reticulatae by two extraction methods（，%，n ＝3）

表2 2 種提取方法提取陳皮中黃酮類成分的含量測定結(jié)果（，%，n ＝ 3）Tab.2 Content determination of flavonoids in Pericarpium Citri Reticulatae by two extraction methods（，%，n ＝3）

樣品編號01 02 03 04 05索氏提取法超聲提取法橙皮苷4.588 3 ± 0.020 2 3.636 2 ± 1.266 8 3.313 5 ± 1.363 3 3.447 6 ± 1.951 9 2.965 5 ± 1.102 7川陳皮素0.016 2 ± 0.000 5 0.028 1 ± 0.032 8 0.024 4 ± 0.004 5 0.033 8 ± 0.004 2 0.060 1 ± 0.008 2桔皮素0.014 1 ± 0.000 5 0.019 5 ± 0.019 3 0.016 5 ± 0.002 4 0.023 3 ± 0.004 7 0.036 8 ± 0.006 0橙皮苷4.791 2 ± 0.014 8 3.742 1 ± 1.115 3 3.879 0 ± 1.598 4 3.366 7 ± 1.991 7 3.542 6 ± 1.594 1川陳皮素0.024 6 ± 0.000 3 0.042 2 ± 0.043 4 0.037 0 ± 0.003 2 0.050 8 ± 0.009 4 0.105 2 ± 0.014 5桔皮素0.021 8 ± 0.000 2 0.031 2 ± 0.033 5 0.026 6 ± 0.003 0 0.038 6 ± 0.006 7 0.077 7 ± 0.009 9

3 討論

3.1 指標成分選擇

2015 年版《中國藥典（一部）》中采用單一成分橙皮苷的含量作為控制陳皮藥材質(zhì)量的指標，陳皮中橙皮苷的含量極高，但除橙皮苷外，多甲氧基黃酮類化合物也是陳皮中含量較高的活性物質(zhì)，具有抗氧化［11］、抗癌［12－13］等藥理作用。作為道地藥材，部分廣陳皮中橙皮苷的含量低于其他產(chǎn)地的陳皮，甚至有的不符合藥典標準［14－15］，故單一成分并不能較好地反映藥材的質(zhì)量。

3.2 陳皮產(chǎn)地選擇

影響中藥材成分含量的因素包括來源品種、產(chǎn)地、藥材的采集加工過程等。陳皮向來以廣東新會陳皮為勝，但產(chǎn)自廣東的陳皮中黃酮類成分的含量并沒有顯著高于其他產(chǎn)地的陳皮［16－18］。而且本課題組經(jīng)過市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)自廣東的陳皮市場價遠高于其他產(chǎn)地的陳皮。故本實驗選擇了除廣東外的其他幾個常見產(chǎn)地的陳皮。

3.3 色譜條件優(yōu)化

本研究中以甲醇 － 醋酸 － 水（35 ∶4 ∶61，V ／ V ／ V）為流動相進行分離，結(jié)果色譜峰的分離效果差；曾考察以甲醇－1%醋酸溶液為流動相進行液相色譜檢測，但分離效果仍較差；曾考察乙腈－1%醋酸溶液系統(tǒng)，以該系統(tǒng)洗脫色譜峰的分離效果并不好。故選取乙腈（A）－2% 醋酸溶液（B）作為流動相，梯度洗脫，每次進樣5 μL。在肖建春等［19］的梯度洗脫程序基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化，將進樣時間由原來的1 h 縮短至30 min，節(jié)約了時間。最終確定梯度洗脫程序 0 ～14 min，85%B→67.5%B；14 ～ 20 min，67.5%B → 43%B；20 ～ 25 min，43%B →33%B；25 ～30 min，33B%→85%B。結(jié)果橙皮苷、川陳皮素、桔皮素3 個成分的色譜分離效果較好，其色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均在1.5 以上。

3.4 提取率分析

由表2 可知，超聲提取法提取橙皮苷、川陳皮素、桔皮素3 種成分的提取率均高于索氏提取法。研究結(jié)果顯示，對于川陳皮素，索氏提取法的提取率低于超聲提取法［20］。川陳皮素和桔皮素均屬于多甲氧基黃酮類成分，在黃酮母核 2 － 苯基色原的 3，5，6，7，8，2′，3′，4′，5′，6′位上有4 個或4 個以上的甲氧基取代，這一結(jié)構(gòu)特性決定其極性較弱，脂溶性好。由于索氏提取法中結(jié)合了石油醚脫色處理，導致川陳皮素在石油醚中溶解，導致提取率降低，這可能是索氏提取法中川陳皮素和桔皮素提取率低的主要原因；橙皮苷的含量較低，可能是橙皮苷在索氏提取過程中，在石油醚中有損耗。但具體原因仍需進一步探索。

3.5 2 種方法優(yōu)缺點比較

索氏提取法具有明顯的缺點：1）提取耗時長，且提取過程中需人工看護；2）根據(jù)樣本量不同，需要大量的萃取溶劑；3）提取過程中通過加熱提高了萃取效率，但對于一些熱不穩(wěn)定物質(zhì)，提取結(jié)果在定量上是不完整的［21］。超聲提取法的優(yōu)點在于：1）節(jié)省溶劑，索氏提取法每批樣品都要耗費80 mL 石油醚和100 mL 甲醇，而超聲提取不需要石油醚；2）節(jié)約時間，超聲提取法僅需30 min，而索氏提取法需要4 ～5 h，且超聲提取可同時提取多份樣品，更節(jié)省時間；3）對于陳皮中的有效成分（橙皮苷、川陳皮素、桔皮素），超聲提取法提取更徹底。

3.6 方法評價

超聲提取法提取橙皮苷、川陳皮素、桔皮素的提取率均高于索氏提取法，簡單便捷。未來研究中將優(yōu)化時間、投料比、提取溫度等條件，完善陳皮的超聲提取方法，為陳皮的質(zhì)量控制提供依據(jù)。