提高大腸桿菌重組蛋白可溶性表達(dá)方法研究進(jìn)展

張　真　汪　燕　馬振剛

提高大腸桿菌重組蛋白可溶性表達(dá)方法研究進(jìn)展

張真汪燕馬振剛

（重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市媒介昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶師范大學(xué)重慶401331）

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與其他外源表達(dá)系統(tǒng)相比具有重組蛋白產(chǎn)量高、易操作、生長速度快和成本低等特點(diǎn)。通過大腸桿菌表達(dá)重組蛋白是一種既高效又經(jīng)濟(jì)的途徑。然而，外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)往往處于還原性環(huán)境的胞質(zhì)中，而在胞質(zhì)中外源蛋白不易形成二硫鍵，出現(xiàn)外源蛋白無法正確折疊的現(xiàn)象，從而形成不可溶的包涵體。文章在近年提高大腸桿菌重組蛋白可溶性表達(dá)研究的基礎(chǔ)上，從選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主、外源蛋白與其他輔助蛋白共表達(dá)、降低蛋白合成速率、提高周質(zhì)蛋白表達(dá)、融合標(biāo)簽表達(dá)、肽標(biāo)簽表達(dá)、替換蛋白質(zhì)中的氨基酸、改變培養(yǎng)基的條件等方面進(jìn)行了綜述，為研究者根據(jù)外源蛋白自身特點(diǎn)，優(yōu)化外源蛋白可溶性表達(dá)方法提供了參考。

外源蛋白；可溶性表達(dá)；大腸桿菌；包涵體

目前大部分蛋白質(zhì)功能研究需要的是可以大量純化并且可溶的蛋白質(zhì)，但不管是天然提取還是使用化學(xué)合成純的蛋白質(zhì)都是非常困難的[1]，而DNA重組技術(shù)提供了一種經(jīng)濟(jì)的外源蛋白獲取方式。大腸桿菌以易于遺傳操作、繁殖速度快、表達(dá)重組蛋白產(chǎn)量高、培養(yǎng)成本低等特點(diǎn)優(yōu)于其他蛋白質(zhì)異源表達(dá)宿主。然而大腸桿菌無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后的修飾，同時(shí)大腸桿菌胞質(zhì)內(nèi)還原性環(huán)境不利于二硫鍵的形成和穩(wěn)定，造成部分重組蛋白無法正確折疊，進(jìn)而形成不溶于水的包涵體。文章就如何提高大腸桿菌外源蛋白可溶性這一問題進(jìn)行了系統(tǒng)的闡述。

1 選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主

選用適當(dāng)?shù)妮d體和菌體相結(jié)合可明顯提高外源蛋白的可溶性，例如，使用在載體上插入一些本身溶解性很高的多肽片段的載體間接地提高外源重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的可溶性。陳阿娜等[2]已經(jīng)證實(shí)某抗體片段在使用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)時(shí)，對(duì)pAVEwayTM質(zhì)粒進(jìn)行改造后，載體攜帶著目的基因在大腸桿菌系統(tǒng)中成功表達(dá)出外源蛋白，且其表達(dá)量和可利用性顯著提升。邢伶越等[3]運(yùn)用翻譯偶聯(lián)和輔助蛋白構(gòu)建了一種最新原核表達(dá)載體并成功使RA蛋白在大腸桿菌中完成高水平非融合性可溶表達(dá)。

另外，選擇合適的菌株明顯可以增強(qiáng)外源蛋白的可溶性及其活性。如果外源可溶性蛋白在大腸桿菌中表達(dá)定位在胞質(zhì)或周質(zhì)空間，極易被大腸桿菌本身定位表達(dá)在此處的蛋白酶所降解而失活，因此使用蛋白酶缺失的菌株就可避免該情況的發(fā)生。IgnatovaZ等[4]人選用 BL 21（DE3） 作為重組青霉素酰胺酶的宿主，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物比使用其他宿主菌的效果好且可溶性更高。由于大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境不是適合二硫鍵形成的有利環(huán)境，且存在類似真核細(xì)胞中翻譯后修飾功能的菌株又極為少見，故而極易導(dǎo)致外源蛋白不能正確表達(dá)。FatemehKhodabakhsh等[5]挑選了TOP10 型大腸桿菌菌株促使外源蛋白形成了正確的二硫鍵，提高了可溶性蛋白的表達(dá)且所表達(dá)的蛋白具有活性。

2 外源蛋白與其他輔助蛋白共表達(dá)

分子伴侶是指細(xì)胞中一類可與正在合成或部分折疊的多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)，主要通過阻止或校正錯(cuò)誤的疏水結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)肽鏈的正確折疊，但不構(gòu)成最終產(chǎn)物的一部分。有關(guān)大腸桿菌的分子伴侶可分為三類，分別是觸發(fā)因子TF、HSP70 和伴侶蛋白。TF之所以被列為三類分子伴侶中的首要分子伴侶，是因?yàn)樗哂须幕滨；樂串悩?gòu)酶活性的細(xì)胞質(zhì)酶[6]。折疊酶是指幫助蛋白質(zhì)正確折疊的酶，例如DsbA和二硫鍵異構(gòu)酶（PDI），其還具有部分分子伴侶的活性。另外，在選用強(qiáng)啟動(dòng)子的情況下，大腸桿菌中外源蛋白的表達(dá)量通常比較可觀，而大腸桿菌自身的輔助折疊因子（如折疊酶和分子伴侶）卻無法保證外源蛋白正確表達(dá)的條件，故共表達(dá)分子伴侶與其他輔助蛋白（如折疊酶）的方式可為源蛋白的成功表達(dá)和正確折疊提供充足的保障，從而提高外源蛋白的可溶性及其表達(dá)產(chǎn)量。王艷芳等[7]已證明2種分子伴侶pG-Tf2和pG-KJE8能顯著提高牛支原體一個(gè)膜蛋白M1的截短片段的可溶性表達(dá)，且不改變其活性。還有研究發(fā)現(xiàn)，多種分子伴侶聯(lián)合使用，可能會(huì)比單獨(dú)使用的效果更佳。目前分子伴侶的合并使用的研究已經(jīng)被報(bào)道，如 DnaKDnaJ-GrpE系統(tǒng)和 GroEL-GroES系統(tǒng)。Chen等[8]已經(jīng)證實(shí)DnaK-DnaJ-GrpE系統(tǒng)對(duì)于在周質(zhì)中高產(chǎn)率地在表達(dá)外源蛋白具有明顯作用。Sahu等[9]運(yùn)用 GroEL-GroES系統(tǒng)也進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

3 降低蛋白合成速率

大腸桿菌的最適培養(yǎng)溫度在38 ℃左右，但通常在該條件下很難得到需要的外源重組蛋白，原因是在這個(gè)溫度條件下，外源蛋白處于高水平表達(dá)狀態(tài)，其正確折疊速率不及新生肽鏈的聚集速率，造成肽鏈的堆積和包涵體的形成。研究表明，肽鏈的形成、折疊和聚集的速率同時(shí)決定最終活性蛋白的表達(dá)率。因此，降低蛋白合成的速率對(duì)提高活性蛋白的產(chǎn)率尤為重要。常用的方法有以下幾種：（1）通過降低培養(yǎng)溫度，一方面在降低蛋白合成的速率的同時(shí)，還可降低可溶性蛋白的降解速率，另一方面還能防止菌體進(jìn)行厭氧生長和最終乙酸的生成，質(zhì)粒的穩(wěn)定性也有相應(yīng)的增加，抗生素的半衰期更長，但溫度過低菌體就會(huì)停止生長，蛋白也不表達(dá)，所以，一般16 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。（2）選擇合適的啟動(dòng)子，一般采用強(qiáng)度較弱的 lac等啟動(dòng)子使翻譯效率與之相關(guān)表達(dá)速率相互匹配，因?yàn)楦邚?qiáng)度的啟動(dòng)子會(huì)使表達(dá)的蛋白多為包涵體。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子能夠使目的基因高效表達(dá)、減少本底表達(dá)并且其誘導(dǎo)方法簡單又實(shí)際[10 ]。（3）使用較低濃度的誘導(dǎo)劑。當(dāng)菌體生長處于指數(shù)生長期時(shí)，繁殖速度快，更有利于可溶性蛋白的表達(dá)，而誘導(dǎo)劑則為終濃度為0.1mMIPTG。

4 提高周質(zhì)蛋白表達(dá)

在大腸桿菌中外源蛋白通常表達(dá)定位在三處——細(xì)胞的胞質(zhì)、周質(zhì)空間以及細(xì)胞外（極少數(shù)）。其中，胞質(zhì)中蛋白表達(dá)效率最高，但在大腸桿菌胞質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)由于肽鏈的二硫鍵無法正確形成，會(huì)促使形成包涵體，此時(shí)還需經(jīng)過其他的步驟才能獲得所需要的功能性蛋白[11 ]。在大腸桿菌中唯一能形成二硫鍵的位置在周質(zhì)空間，因此要想獲取可溶性蛋白，可利用插入的信號(hào)肽將外源蛋白定位在周質(zhì)中。P．Oelschlaeger等[12 ]在大腸桿菌中表達(dá)scFv，s單鏈抗體片段時(shí)，在scFv，s的N端連接上信號(hào)肽PelB，該信號(hào)肽的插入成功引導(dǎo)外源蛋白表達(dá)定位在周質(zhì)空間中?；羰涝萚13 ]將抗 VEGF單克隆抗體 Fab片段的CDNA與OmpA信號(hào)肽連接并克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒，其后在細(xì)胞周質(zhì)中成功檢測(cè)到產(chǎn)物，將其純化后仍有相關(guān)活性。

5 融合標(biāo)簽表達(dá)

由于使用融合標(biāo)簽表達(dá)可提高宿主中外源表達(dá)時(shí)的可溶性，所以當(dāng)改變環(huán)境條件（如溫度）卻不能解決外源蛋白可溶性問題時(shí)可以選擇使用融合標(biāo)簽表達(dá)的方法來緩解該情況。融合蛋白是指將靶蛋白連接在一些易于表達(dá)或純化的“融合標(biāo)簽”（fusiontag）的N－末端或C－末端，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)外源蛋白的可溶性表達(dá)[14-15]，常見的融合標(biāo)簽見1。除此之外，最近還發(fā)現(xiàn)一種新型的FH8[16]標(biāo)簽。Costa等[17]將GST、NusA、His、MBP、Trx幾種常用的標(biāo)簽與8 kDa的FH8新融合標(biāo)簽進(jìn)行了比較，研究結(jié)果表明FH8標(biāo)簽的促融作用比MBP、NusA或Trx融合標(biāo)簽更為顯著，而且經(jīng)過該標(biāo)簽表達(dá)出的目的蛋白仍保持原有生物活性，因此FH8標(biāo)簽與其它大分子融合標(biāo)簽相比可以作為一種新的融合標(biāo)簽。HanY等[18 ]已證實(shí)麥芽三糖結(jié)合蛋白可作為新的融合標(biāo)簽增加靶蛋白在大腸桿菌中的溶解度，即HE-MBP（Pyr）融合標(biāo)簽增加異源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的相對(duì)表達(dá)和溶解度。

表1　常見的融合標(biāo)簽

6 肽標(biāo)簽

小肽標(biāo)簽已被用作外源蛋白的溶解度增強(qiáng)標(biāo)簽，幾乎更早于蛋白質(zhì)融合標(biāo)簽。這些肽標(biāo)簽相對(duì)較短，主要由一到兩個(gè)氨基酸且重復(fù)不同的次數(shù)組成，通?？傞L不超過15 個(gè)殘基[19 ]。小肽標(biāo)簽可在不干擾相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)和不損害蛋白質(zhì)活性的情況下發(fā)揮作用，且在后期不需要額外的步驟對(duì)其進(jìn)行去除。Hage, N.等[20 ]已證實(shí)在蛋白的C-末端添加一種六賴氨酸作為標(biāo)記，可明顯提高由其假定的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的重組BabA的產(chǎn)量。且ParaskevopoulouV所在的實(shí)驗(yàn)小組將一種周質(zhì)表達(dá)方法和肽標(biāo)記兩種方法相結(jié)合，已成功表達(dá)出一種異源粘附素。

7 替換氨基酸

包涵體形成的一個(gè)關(guān)鍵因素是氨基酸序列，因此替換其中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸來增加可溶性蛋白的表達(dá)也為一種可行的方法。其原理可能是由于蛋白質(zhì)的氨基酸被替換后，其穩(wěn)定性增加或是疏水性發(fā)生了改變。KimBG等[21 ]利用氨基酸替換的方法成功使α-1，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的可溶性蛋白表達(dá)水平和活性顯著提高，并成功申請(qǐng)專利。這表明替換氨基酸的方法可行，但諸多細(xì)節(jié)問題還仍需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

8 改變培養(yǎng)基的條件

培養(yǎng)大腸桿菌的環(huán)境也是影響外源蛋白的可溶性表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。首先，可根據(jù)所選擇的菌株和需要表達(dá)的目的外源蛋白的特征來選擇適當(dāng)?shù)膒H，并保持培養(yǎng)基中pH的相對(duì)穩(wěn)定（通氣的環(huán)境更有利于高產(chǎn)量活性蛋白的表達(dá)）。培養(yǎng)基的pH與外源蛋白的等電點(diǎn)相差越大，所表達(dá)的蛋白就更容易形成可溶性蛋白。其次，加入一些微量元素（如Zn、Mg、Cu等）、碳源（如蔗糖、甘油等）、磷酸鉀緩沖液、乙醇等化學(xué)物質(zhì)，對(duì)提高外源蛋白的可溶性有極顯著的作用。楊彩云等[22]在利用重組工程菌表達(dá)AiiA蛋白時(shí)，在以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的條件下，在培養(yǎng)基中加入了蔗糖等不同種碳源、磷酸鉀緩沖液（保證pH值的穩(wěn)定）和一些微量元素等，結(jié)果表明這些化學(xué)物質(zhì)在不同程度上提高了所表達(dá)的外源蛋白的可溶性。

9 展望

目前大腸桿菌作為外源蛋白表達(dá)的首選宿主菌，雖然已有許多提高外源蛋白可溶性表達(dá)的方法，但是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)種類繁多和蛋白質(zhì)性質(zhì)各異，使得這些方法仍存在一些局限，所以必須經(jīng)過大量的試驗(yàn)才能找到合適的宿主菌與載體，實(shí)現(xiàn)具體蛋白質(zhì)具體分析。在蛋白表達(dá)時(shí)最主要的缺陷是在高效表達(dá)時(shí)易形成包涵體，所以想要獲得可溶性外源蛋白還需要不斷地進(jìn)行新的嘗試與摸索。

[1]ANDERSSONL,BLOMBERGL,FLEGELMBlombergL,etal.Largescalesynthesisofpeptides[J].Biopolymer-s,2000(3):227250.

[2]陳阿娜,葉生梅,孟娜,等.外源蛋白在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)和胞外分泌策略研究綜述[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2015(13):25-27.

[3]邢伶越,謝德健,葉丙雨,等.利用翻譯偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)廣譜抗病毒蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)[J].軍事醫(yī)學(xué),2015(8):597-601.

[4]Ignatova Z,Mahsunah A,Georgieva M,et al.Improvement of Posttranslational Bottlenecks in the Production of Penicillin Amidase in Recombinant Escherichia coli Strains[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(2):1237-1245.

[5] KHODABAKHSHF, DEHGHANIZ, ZIAMF, etal. CloningandExpressionofFunctionalReteplaseinEscherichiacoliTOP10[J]. AvicennaJournalofMedicalBiotechnolo-gy,2013(3):168175.

[6] OHE, BCHERAH, SANDIKCIA, etal. Selectiveribosomeprofilingrevealsthecotranslationalchaperoneactionoftriggerfactorinvivo[J].Cell,2011(6):129512308.

[7]王艷芳,周雅坪,張新竹,等.四種分子伴侶促進(jìn)牛支原體膜蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2018(12):75-83.

[8] ChenY, SongJ, SuiSF, etal. DnaKandDnaJfacilitatedthefoldingprocessandreducedinclusionbodyformationofmagnesiumtransporterCorAoverexpressedinEscherichiacoli. ProteinExprPurif,2003(2):221-231.

[9] NesbethDN, Perez-PardoMA, AliS, etal. GrowthandProductivityImpactsofPeriplasmicNucleaseExpressioninanEscherichiacoliFab＇FragmentProductionStrain. Biotechn-olBioeng,2012(2):517-527.

[10]張宇萌,童梅,陸小冬,等.提高大腸桿菌可溶性重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2015(5):118-124.

[11]羅莉,秦嬌榮,王明蓉,重組 sTNFR 1蛋白包涵體洗滌方法的研究[J].中國生物工程雜志,2013(9):4552.

[12] OELSCHLAEGERP,LANGES, SCHMITTJ, etal. Identificationoffactorsimpedingtheproductionofasingle-chainantibodyfragmentinEscherichiacolibycomparinginvivoandinvitroexpression[J]. AppliedMicrobiologyBiotech-nology,2003(2): 123-123.

[13]霍世元,朱文華,滕凌,等.抗 VEGF單克隆抗體 Fab片段在大腸桿菌的表達(dá)[J].中國生物工程雜志,2014(10):1085-1092.

[14] GUOWanhua, CAOLin, ZHANGJia, etal. HighlevelsolubleproductionoffunctionalribonucleaseinhibitorinEscherichiacolibyfusingittosolublepartners[J]. ProteinExpressionandPurification,2011(2):185-192.

[15]HUANGJing, CAOLin, GUOWanhua, etal. EnhancedsolubleexpressionofrecombinantFlavobacteriumheparinumheparinaseIinEscherichiacolibyfusingitwithvarioussolublepartners[J]. ProteinExpressionandPurification,2012(2):169-176.

[16] COSTAS, DevelopmentofaNovelFusionSystemforRecombinantProteinProductionandPurificationinEscherichiacoli[D]. Portugal:UniversityofPortugal,2013.

[17] COSTASJ, ALMEIDAA, CASTROA, etal. ThenovelFh8 andHfusionpartnersforsolubleproteinexpressioninEscherichiacoli:acomparisonwiththetraditionalgenefusiontechnology[J]. AppliedMicrobiologyBiotechnology,2013(15):6779-6791.

[18] Han Y, Guo W, Su B, et al. High-level expression of soluble recombinant proteins in Escherichia coli using an HE-maltotriose-binding protein fusion tag[J]. Protein expression and purification,2018(142):25-31.

[19] ParaskevopoulouV, FalconeF. Polyionictagsasenhancersofproteinsolubilityinrecombinantproteinexpression[J]. Microorganisms,2018(2):47.

[20] Hage N , Renshaw J G , Winkler G S , et al. Improved expression and purification of the Helicobacter pylori adhesin BabA through the incorporation of a hexa-lysine tag[J]. Protein Expression and Purification, 2015, 106:25-30.

[21] KimBG, ChoiYH. Helicobacterpyloriα-1,3 fucosyltransferasegeneandproteinwithimprovedsolubleproteinexpressionandactivity, andthereofapplicationforsynthesisofα-1,3 fucosyloligosaccharide:U.S. PatentApplication 10/336,990[P].2019-7-2.

[22]楊彩云,杜慈,黃平,等.重組 AiiA蛋白可溶性表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011(6):1219-1227.

Advances in Improving the Soluble Expression of Escherichia Coli Recombinant Protein

Zhang ZhenWang YanMa Zhengang

（Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing Key Laboratory of Vector Insects, Chongqing Normal University, Chongqing 401331）

Compared with other exogenous expression systems, escherichia coli expression system has the characteristics of high yield, easy operation, fast growth rate and low cost of recombinant protein. It is an efficient and economical way to express recombinant protein through escherichia coli. However, when expressed in escherichia coli, exogenous proteins tend to be in the cytoplasm of the reductive environment, whereas in cytoplasm, exogenous proteins are not easy to form disulfide bonds, and foreign proteins cannot fold properly, thus forming insoluble inclusion bodies. On the basis of improving the soluble expression of escherichia coli recombinant protein, the article summarized from selecting the appropriate carrier and the host, exogenous proteins are co-expressed with other helper proteins, reducing the rate of protein synthesis, improving the periplasmic protein expression, expression of fusion tag expression, peptide tag expression, replacing amino acids in a protein, changing the condition of culture medium and other aspects, providing a reference for researchers to optimize the soluble expression of exogenous proteins according to their own characteristics.

exogenous proteins; soluble expression; escherichia coli; inclusion body

Q78

A

2095-1205(2019)07-37-04

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.07.23

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目《東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白及其與侵染功能相關(guān)性研究》（No：31770160），重慶市教委科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目《東方蜜蜂微孢子蟲孢壁蛋白Ncswp8的亞細(xì)胞定位及與侵染相關(guān)功能研究》（No：KJQN201800524），重慶市科委科學(xué)研究項(xiàng)目《基于RNAi技術(shù)的蜜蜂Aub基因抑制腸道微孢子機(jī)理研究》（No：cstc2018jcyjAX0832）。

張真（1996- ），女，漢族，碩士，研究方向?yàn)槔ハx病原微生物學(xué)。

馬振剛(1985- )，男，漢族，博士，副教授，研究方向：資源昆蟲及其病原微生物學(xué)。