高粱抗絲黑穗病菌4 號(hào)生理小種SRAP 標(biāo)記分析

司浩浩，段永紅，孫 毅，張歡歡，張 旭

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

高粱絲黑穗病是一種對(duì)作物生產(chǎn)有嚴(yán)重影響的病害[1-3]，是全世界普遍存在的重要高粱病害，該病會(huì)對(duì)高粱穗部的結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致高粱減產(chǎn)，甚至?xí)斐深w粒無收[4]。在我國北方地區(qū)，尤其是內(nèi)蒙古和東北三省，絲黑穗病已經(jīng)成為一種常見病害，嚴(yán)重影響高粱的生產(chǎn)效益[5-6]。因此，高粱絲黑穗病的防治對(duì)高粱的安全生產(chǎn)具有重要意義。

高粱絲黑穗病是由孢堆黑粉菌引起的，一般在抽穗期時(shí)才能觀察到病癥，病癥最直觀的癥狀是果穗部全部或者大片地變成黑粉狀，病株明顯比其他植株矮小。其中，發(fā)病初期的癥狀是穗部的下部膨大，打開穗葉后可以觀察到白色的棒狀物，叫作“烏米”；發(fā)病中期，烏米會(huì)變大、變硬；發(fā)病后期，烏米由白轉(zhuǎn)黑，開始出現(xiàn)黑色絲狀物和黑粉，不僅使穗部受損顆粒無收，而且也會(huì)感染葉子，使葉子產(chǎn)生條斑，影響植物光合作用，進(jìn)而影響植物生長。有學(xué)者研究認(rèn)為，高粱絲黑穗病菌不存在分化[7]，但國內(nèi)外許多研究也發(fā)現(xiàn)，高粱絲黑穗病菌包括多個(gè)類型，而且分化程度逐漸增大[8-11]。病菌的分化趨勢(shì)使作物對(duì)病菌的抗性減弱，需要不斷培育新的抗病品種。

高粱絲黑穗病菌具有顯著的分化趨勢(shì)，新的生理小種的出現(xiàn)會(huì)大大降低原有抗病品種的抗性，對(duì)高粱收獲造成新的威脅。張福耀等[12]研究發(fā)現(xiàn)了高粱絲黑穗病菌4 號(hào)生理小種，該小種給高粱育種和生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失，研究高粱絲黑穗病4 號(hào)生理小種相關(guān)抗性基因的遺傳規(guī)律顯得尤為重要，急需篩選與抗性基因相關(guān)的連鎖標(biāo)記，明確其遺傳規(guī)律。

本研究選用高粱感病品種三尺三和抗病品系961541 作為試驗(yàn)材料，采用SRAP 標(biāo)記，從分子水平分析感病植株與抗病植株基因組差異，旨在實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站進(jìn)行，于2015 年以961541 品系（對(duì)1，2，3，4 號(hào)生理小種均表現(xiàn)免疫）為母本、以三尺三為父本進(jìn)行雜交獲得雜交種F1，經(jīng)海南加代獲得F2群體。961541 品系和三尺三由山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接菌 將高粱父母本及F1、F2群體采用菌土接菌法播種于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站，于高粱抽穗期調(diào)查高粱的感染情況，并計(jì)算發(fā)病率。

1.2.2 DNA 提取 在苗期對(duì)高粱親本及211 個(gè)F2群體單株采樣，用CTAB 法（十六烷基三甲基溴化銨法）[13-15]對(duì)各單株進(jìn)行基因組DNA 提?。ㄆ浠驹硎怯梦锢矸椒ㄆ扑橹参锛?xì)胞，加入CTAB 緩沖液將DNA 溶解出來，再用氯仿- 異戊醇抽提去除蛋白質(zhì)，最終得到DNA）。CTAB 緩沖液包括4 種主要試劑：12.5 mmol/L 的PEX，100 mmol/L 的Tris- HCl（pH＝8.0），10mmol/L的EDTA（pH＝8.0）和700mmol/L 的NaCl。最后將提取的DNA 溶于適量的TE（pH＝8.0）緩沖液中，于- 70 ℃冰柜中保存。

1.2.3 抗感池的構(gòu)建 采用分離群體混合分析法（BSA）建立抗感池。根據(jù)F2群體單株發(fā)病情況，挑選抗病株、感病株各15 株，提取其基因組DNA 后等量混合。分離群體混合分析法是利用相對(duì)或極端差異性狀進(jìn)行功能基因挖掘的一種方法，其基本原理是在分離群體中只對(duì)目標(biāo)性狀的表現(xiàn)型進(jìn)行分類，在數(shù)量達(dá)到一定程度后，抗感池間整體差異最顯著的基因即與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記。

1.2.4 檢測(cè)DNA 的濃度和純度 取5 μL 的DNA溶液，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定高粱DNA 的A260/A280值，即得DNA 的純度和濃度；并用瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA 的質(zhì)量。

1.2.5 SRAP 標(biāo)記所用引物來源 17 對(duì)上、下游SRAP 引物由上海生工合成，其序列如表1 所示。

表1 SRAP 標(biāo)記的引物序列

1.2.6 SRAP 標(biāo)記的擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在EDC-810 型基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。SRAP- PCR 的最適反應(yīng)體系（10 μL） 為：DNA 模板1.0 μL、10×PCR Buffer 1.0 μL、Taq DNA 聚合酶0.2 μL、dNTPs 1.0 μL、上下游引物各0.3 μL，ddH2O 6.2 μL。SRAP 的操作過程為：在94 ℃下預(yù)變性3 min；在94 ℃下變性1 min，在57 ℃下退火45 s，在72 ℃下延伸1 min，循環(huán)35 次；在72 ℃延伸10 min，于4 ℃下保存。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠板的制備 先將沖洗干凈的用于制備凝膠板的2 塊玻璃板烘干，2 塊成對(duì)插入膠條中，并固定在電泳儀上，用1.5%的瓊脂糖凝膠封膠，靜置數(shù)分鐘待其凝固；然后將制備好的8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（30%非變性聚丙烯酰胺凝膠貯液11 mL；10×TBE 溶液4 mL；雙蒸水26 mL；10%的APS 溶液267 μL；TEMED 67 μL）加入燒杯，用玻璃棒攪拌使其充分混勻；最后將其注入到封好口的玻璃板中，插入合適寬度的梳子，豎直放置，直到徹底凝固。

1.2.8 SRAP 標(biāo)記電泳顯色 其參照王運(yùn)斌等[16]的顯色方法進(jìn)行，在具體的步驟中有所改進(jìn)。以Marker 為對(duì)照，用8%的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，200 V 恒壓下電泳40 min，然后銀染顯色，使帶在膠板上清晰可讀。

1.2.9 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與引物DNA 序列比對(duì) 在紫外燈下快速將差異片段切下，將DNA 從膠中分離出來，分別以2 個(gè)引物采用Sanger 法進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003 進(jìn)行常規(guī)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間調(diào)查數(shù)據(jù)分析

田間調(diào)查結(jié)果顯示（表2），種植的三尺三/961541組合中，感病親本三尺三的發(fā)病率為37.5%，抗病親本961541 的發(fā)病率為0，F(xiàn)1的發(fā)病率為0；田間種植的F2群體共211 株，其中，感病植株16 株，抗病植株195 株，發(fā)病率為7.58%，F(xiàn)2的發(fā)病率比較接近1/16，推測(cè)4 號(hào)生理小種可能受2 對(duì)非等位基因控制。適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明（表3），抗感植株比率接近15∶1，χ2值分別是0.027，0.406（P＞0.05），說明高粱絲黑穗病4 號(hào)生理小種的抗性受2 對(duì)基因控制。

表2 親本及F2 群體的絲黑穗侵染鑒定

表3 F2 群體性狀分離比的適合性檢驗(yàn)

2.2 高粱SRAP 標(biāo)記分析

2.2.1 高粱親本間多態(tài)性引物篩選 所用的289 對(duì)SRAP 引物中有119 對(duì)引物在親本間表現(xiàn)差異，多態(tài)性引物的總比率為41.18%，119 對(duì)引物條帶平均多態(tài)性比率為37.27%（表4）。其中，引物Em4/Me6 在親本間擴(kuò)增的電泳結(jié)果如圖1 所示。

表4 親本間引物擴(kuò)增的多態(tài)性

續(xù)表4

2.2.2 高粱抗感池間多態(tài)性引物篩選 用篩選出的119 對(duì)引物在F2構(gòu)建的抗感池中繼續(xù)篩選得出，119 對(duì)引物中共有9 對(duì)引物在抗感池間表現(xiàn)出差異，多態(tài)性引物的總比率為7.56%，9 對(duì)引物條帶的平均多態(tài)性比率為53.52%（表5）。

表5 抗感池間引物擴(kuò)增的多態(tài)性

引物Em4/Me6 在抗感池間擴(kuò)增的電泳結(jié)果如圖2 所示。

2.2.3 高粱抗感單株間多態(tài)性引物驗(yàn)證 用篩選出的9 對(duì)引物分別在15 個(gè)感病單株DNA 和15 個(gè)抗病單株DNA 中進(jìn)行篩選，結(jié)果僅有1 對(duì)SRAP引物Em4/Me6 存在差異，多態(tài)性引物的比率為11.11%。

引物Em4/Me6 在抗感病單株中擴(kuò)增的電泳結(jié)果如圖3 所示。

2.2.4 SRAP 標(biāo)記篩選結(jié)果 選用親本間有多態(tài)性的引物在F2構(gòu)建的抗感池中繼續(xù)篩選，篩選出9 對(duì)多態(tài)性引物在抗感池間有差異；隨后用F2單株DNA 驗(yàn)證，結(jié)果僅有1 對(duì)SRAP 引物Em4/Me6 存在差異。其中，抗池的條帶帶型與母本961541 相同，感池的條帶帶型與父本三尺三相同。對(duì)上述SRAP 差異片段回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，未成功。失敗的原因可能主要是由于DNA 保存時(shí)間過長，造成DNA 降解。

3 結(jié)論與討論

3.1 高粱抗絲黑穗病基因遺傳規(guī)律探討

目前，已有學(xué)者選用RAPD、SSR 等標(biāo)記研究高粱絲黑穗抗性基因，并得到了不同的研究結(jié)果。鄒劍秋等[17]采用SSR 技術(shù)對(duì)3 號(hào)生理小種進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該小種符合質(zhì)量性狀遺傳規(guī)律，抗病性受2 對(duì)非等位基因控制，并且存在基因互作，篩選出的2 個(gè)抗性標(biāo)記分別位于高粱第2 號(hào)、6 號(hào)染色體上。OHBJ 等[18]研究表明，美國5 號(hào)生理小種的抗病基因位于第8 號(hào)染色體上，受1 對(duì)基因控制。姜鈺等[19]研究表明，3 號(hào)生理小種的抗病基因位于第3 號(hào)染色體上，抗病性為顯性，抗病性受1 對(duì)非等位基因控制，抗性差異片段大小約為230 bp。白春明等[3]用SLAF 標(biāo)記測(cè)序和236 個(gè)自然群體抗病性鑒定表型，進(jìn)行了全基因組范圍SNP 關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，主要抗病位點(diǎn)位于第8 號(hào)染色體上。

本研究經(jīng)過親本間、基因池、單株的共同篩選驗(yàn)證，初步篩選到1 個(gè)與抗絲黑穗病相關(guān)的SRAP標(biāo)記，差異片段大小約為250 bp，但由于缺乏錨定標(biāo)記，沒有將差異標(biāo)記定位到染色體上。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高粱絲黑穗病4 號(hào)生理小種的抗病性受2 對(duì)非等位基因控制，符合質(zhì)量性狀遺傳，抗病性是顯性，感病性是隱性，與楊慧勇等[20]的研究結(jié)果相近。但也有學(xué)者研究認(rèn)為，高粱抗絲黑穗病由數(shù)量性狀遺傳控制，還有加性、顯性和上位等效應(yīng)的微弱作用，高粱絲黑穗病菌有多個(gè)類型，而且具有嚴(yán)重的分化趨勢(shì)，其遺傳規(guī)律仍有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)用4 號(hào)生理小種對(duì)高粱種質(zhì)961541 抗病性的研究完善了我國高粱絲黑穗病菌生理小種鑒別寄主體系。眾多研究結(jié)果顯示，不同材料對(duì)不同生理小種的抗病基因位點(diǎn)明顯不同。所以，今后應(yīng)該緊密結(jié)合分子標(biāo)記和田間育種，選擇更多高粱品種進(jìn)行雜交，并分析其抗病基因，從而提高品種抗性和育種效率。

3.2 SRAP 篩選與高粱抗絲黑穗病相關(guān)標(biāo)記的實(shí)用性分析

LI 等[21]篩選到1 個(gè)與中國白菜雄性不育基因相關(guān)的SRAP 標(biāo)記、1 個(gè)與油菜恢復(fù)基因連鎖的SRAP 標(biāo)記和1 個(gè)與芹菜病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP 標(biāo)記。潘俊松等[22]采用SRAP 標(biāo)記方法將黃瓜始花節(jié)位性狀控制基因定位在第IX 連鎖群上。SRAP 標(biāo)記具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、在基因組中分布均勻的特點(diǎn)，已經(jīng)被應(yīng)用于水稻、棉花、油菜、馬鈴薯、蘋果、柑橘類果樹、櫻桃、梅子、大蒜、萵苣及芹菜等植物的研究中[23-27]。本研究選用SRAP 技術(shù)初步篩選到1 個(gè)與高粱抗絲黑穗病相關(guān)的SRAP標(biāo)記，差異片段大小約為250 bp，實(shí)現(xiàn)了在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)快速鑒定高粱抗絲黑穗病病株。