兩種色譜柱分離37種脂肪酸組分研究

鄒燕娣，包李林，周青燕，熊巍林，張謙益，周雙全

(道道全糧油股份有限公司 規(guī)劃發(fā)展研究院質(zhì)量管理中心，湖南 岳陽(yáng) 414000)

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，人們對(duì)飲食越來(lái)越重視，食用植物油作為日常生活中的必需品，其品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也日益受關(guān)注[1-3]。植物油中組分較復(fù)雜，從四碳酸到二十二碳酸的碳鏈長(zhǎng)度，共有37種脂肪酸。亞油酸和亞麻酸是人體必需的脂肪酸，具有防止血液中膽固醇的增加和沉積、軟化血管、防止高血壓和心血管疾病等功能[4-11]。在不飽和脂肪酸中，按照幾何異構(gòu)體的不同可分為順式和反式脂肪酸；按照第一個(gè)雙鍵距離甲基端數(shù)目的差異主要有n-3、n-6和n-9系脂肪酸。順式結(jié)構(gòu)的油酸或亞油酸容易被人體吸收，可軟化人體血管，而反式結(jié)構(gòu)的不被人體吸收，且長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人體血管產(chǎn)生不良影響，因而有必要對(duì)順式和反式結(jié)構(gòu)的脂肪酸組分進(jìn)行測(cè)定，以判定油脂的品質(zhì)[12-13]。目前，國(guó)標(biāo)或文獻(xiàn)資料主要采用氣相色譜結(jié)合100 m的強(qiáng)極性柱分離37種脂肪酸組分，但并沒(méi)有就37種脂肪酸組分的分離條件進(jìn)行詳細(xì)研究，比如標(biāo)樣質(zhì)量濃度、分流比、色譜柱流速或程序升溫；且30 m的強(qiáng)極性柱是否能應(yīng)用于油樣中37種脂肪酸組分的分離也沒(méi)有相關(guān)或具體的研究[14-15]。據(jù)了解100 m的色譜柱價(jià)格將近10 000元，而30 m的色譜柱只需要3 000多元，成本較低。本試驗(yàn)研究?jī)煞N常用的強(qiáng)極性色譜柱(CD-2560和DB-WAX)分離37種脂肪酸混合標(biāo)樣和植物油，探索最佳分離條件，為測(cè)定植物油中各種脂肪酸組分提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

37種脂肪酸甲酯混標(biāo)(10 mg/mL，1 mL)分別為C4∶0、C6∶0、C8∶0、C10∶0、C11∶0、C12∶0、C13∶0、C14∶0、C14∶1、C15∶0、C15∶1、C16∶0、C16∶1、C17∶0、C17∶1、C18∶0、C18∶1n9t、C18∶1n9c、C18∶2n6t、C18∶2n6c、C20∶0、C18∶3n6、C20∶1、C18∶3n3、C21∶0、C20∶2、C22∶0、C20∶3n6、C22∶1n9、C20∶3n3、C20∶4n6、C23∶0、C22∶2、C24∶0、C20∶5n3、C24∶1、C22∶6n3，上海安譜；異辛烷，色譜純；氫氧化鉀，分析純；甲醇，色譜純，Sigma公司；超純水；0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液；四級(jí)菜籽油、大豆油、一級(jí)葵花籽油、芝麻油、玉米油，公司自給。

1.1.2 儀器與設(shè)備

7890B安捷倫高效氣相色譜儀；CD-2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將37種脂肪酸甲酯混標(biāo)用異辛烷稀釋至10 mL，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，于-20℃保存。

1.2.2 樣品前處理

稱取油樣約0.05 g至10 mL具塞比色管中，加入4 mL異辛烷，搖勻，然后加入1 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，置于旋轉(zhuǎn)混勻器上于1 500 r/min 旋轉(zhuǎn)2 min，加入1 mL超純水，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)1 min，靜置分層后，取上層清液待測(cè)。

1.2.3 氣相色譜分析條件

進(jìn)樣口溫度280℃；檢測(cè)器溫度290℃；隔墊吹掃流量3 mL/min；載氣為氮?dú)?，純?.999 99；空氣純度0.999 99；氫氣由氫氣發(fā)生器制備；進(jìn)樣量1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD-2560色譜柱色譜條件的探討

2.1.1 色譜柱流速的影響

固定混標(biāo)質(zhì)量濃度為1 mg/mL，分流比為 70∶1，程序升溫為100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃,保持30 min，色譜柱流速分別設(shè)定為0.7、0.6、0.55、0.5、0.45 mL/min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)流速為0.7 mL/min時(shí)，37種組分中C24∶0和C20∶5n3的峰分不開(kāi)；當(dāng)流速為0.6、0.55、0.5 mL/min時(shí)，37種脂肪酸分離度均良好；當(dāng)流速為0.45mL/min 時(shí)，37種組分中C23∶0和C20∶4n6的峰分離度差。本試驗(yàn)選擇色譜柱流速為0.55 mL/min，其氣相色譜圖如1所示。

注：1.C4∶0；2.C6∶0；3.C8∶0；4.C10∶0；5.C11∶0；6.C12∶0；7.C13∶0；8.C14∶0；9.C14∶1；10.C15∶0；11.C15∶1；12.C16∶0；13.C16∶1；14.C17∶0；15.C17∶1；16.C18∶0；17.C18∶1n9t；18.C18∶1n9c；19.C18∶2n6t；20.C18∶2n6c；21.C20∶0；22.C18∶3n6；23.C20∶1；24.C18∶3n3；25.C21∶0；26.C20∶2；27.C22∶0；28.C20∶3n6；29.C22∶1n9；30.C20∶3n3；31.C20∶4n6；32.C23∶0；33.C22∶2；34.C24∶0；35.C20∶5n3；36.C24∶1；37.C22∶6n3。

圖1 CD-2560色譜柱流速為0.55 mL/min時(shí)37種脂肪酸組分氣相色譜圖

2.1.2 分流比的影響

固定混標(biāo)質(zhì)量濃度為1 mg/mL，色譜柱流速為0.55 mL/min，程序升溫為100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃，保持30 min，分流比分別設(shè)為10∶1、30∶1、50∶1、60∶1、70∶1。試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)分流比為10∶1～70∶1時(shí)，37種脂肪酸甲酯組分均能完全分離?？紤]到分流比太小，會(huì)因油樣中的油酸和亞油酸濃度過(guò)大，導(dǎo)致C18∶1n9t和C18∶1n9c、C18∶2n6t和C18∶2n6c這兩組峰分離效果不佳，但是分流比太大，也會(huì)使得油樣中一些微量組分未能檢測(cè)出來(lái)，如C24∶0、C24∶1等。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇分流比為70∶1。

2.1.3 程序升溫的影響

固定混標(biāo)質(zhì)量濃度為1 mg/mL，色譜柱流速為0.55 mL/min，分流比為70∶1，分別設(shè)定程序升溫：程序升溫①，100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃，保持30 min；程序升溫②，130℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃，保持30 min；程序升溫③，100℃保持13 min，以10℃/min速率上升至180℃，保持6 min，以1℃/min速率上升至200℃，保持20 min，以4℃/min速率上升至230℃，保持30 min。

試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)采用程序升溫①和②時(shí)，37種脂肪酸組分分離良好，但是采用程序升溫①時(shí)，C4∶0分離效果比程序升溫②佳；當(dāng)采用程序升溫③時(shí)，只能分離35種脂肪酸，其中C24∶0和C20∶5n3分不開(kāi)。因此，本試驗(yàn)采用程序升溫①。

2.2 DB-WAX色譜柱色譜條件的探討

試驗(yàn)結(jié)果表明，色譜柱DB-WAX的最佳分離條件為：混標(biāo)質(zhì)量濃度1 mg/mL，色譜柱流速0.55 mL/min，分流比70∶1，程序升溫為100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃，保持50 min。其最佳分離效果如圖2所示。

注：1.C4∶0；2.C6∶0；3.C8∶0；4.C10∶0；5.C11∶0；6.C12∶0；7.C13∶0；8.C14∶0；9.C14∶1；10.C15∶0；11.C15∶1；12.C16∶0；13.C16∶1；14.C17∶0；15.C17∶1；16.C18∶0；17.C18∶1n9c、C18∶1n9t；18.C18∶2n6c、C18∶2n6t；19.C18∶3n6；20.C18∶3n3；21.C20∶0；22.C20∶1；23.C20∶2；24.C21∶0；25.C20∶3n6；26.C20∶3n3；27.C20∶4n6；28.C22∶0；29.C22∶1n9；30.C22∶2；31.C23∶0；32.C24∶0；33.C24∶1；34.C20∶5n3；35.C22∶6n3。

圖2 DB-WAX色譜柱分離37種脂肪酸組分最佳氣相色譜圖

將四級(jí)菜籽油分別采用CD-2560色譜柱和DB-WAX色譜柱測(cè)定其脂肪酸組成。根據(jù)CD-2560色譜柱測(cè)定37種脂肪酸標(biāo)樣組分出峰順序，得出四級(jí)菜籽油各組分含量和名稱，再將其與DB-WAX色譜柱測(cè)定的四級(jí)菜籽油色譜圖進(jìn)行比較，將含量幾乎一致的命為同一種物質(zhì)，得出各種組分含量和名稱，如圖3所示。

由圖2可知，C18∶1n9c、C18∶1n9t和C18∶2n6c、C18∶2n6t，這兩組同分異構(gòu)體并沒(méi)有分離，但是四級(jí)菜籽油樣中的卻能分離(圖3)，具體原因有待研究。綜上所述，DB-WAX色譜柱可用于37種脂肪酸組分的測(cè)定。

2.3 樣品的測(cè)定

分別采用CD-2560色譜柱和DB-WAX色譜柱對(duì)四級(jí)菜籽油、芝麻油、一級(jí)葵花籽油、大豆油、玉米油5種油樣進(jìn)行脂肪酸組成測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可知，CD-2560色譜柱和DB-WAX色譜柱對(duì)油樣中脂肪酸組成及含量測(cè)定結(jié)果幾乎一致，說(shuō)明兩者的分離效果相當(dāng)。四級(jí)菜籽油中不飽和脂肪酸含量最高，達(dá)92.56%，飽和脂肪酸含量為6.76%，其余4種植物油的不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸含量相差不大，分別約為83%和15%。

注：1.C14∶0；2.C15∶0；3.C16∶0；4.C17∶0；5.C17∶1；6.C18∶0；7.C18∶1n9c；8.C18∶1n9t；9.C18∶2n6c；10.C18∶2n6t；11.C18∶3n6；12.C18∶3n3；13.C20∶0；14、15.C20∶1；16.C20∶2；17.C21∶0；18.C20∶4n6；19.C22∶0；20、21.C22∶1n9；22.C23∶0；23.C24∶0；24.C24∶1。

圖3 DB-WAX色譜柱分離四級(jí)菜籽油脂肪酸組成氣相色譜圖

續(xù)表1%

脂肪酸DB-WAX色譜柱CD-2560色譜柱四級(jí)菜籽油一級(jí)葵花籽油芝麻油玉米油大豆油四級(jí)菜籽油一級(jí)葵花籽油芝麻油玉米油大豆油C20∶3n6- - - - - - - - - - C21∶0- - - - 0.030- 0.028- - 0.270C22∶00.5100.3900.1800.1500.3700.4900.3800.1600.1100.360C22∶1n921.1900.2500.2700.3700.26020.3400.0300.0300.2400.250C22∶20.2700.1500.2300.0700.1900.250- 0.0500.0680.190C23∶0- 0.070- - 0.066- 0.130- - 0.065C24∶00.1900.1300.1000.1300.0960.2100.0800.1100.1400.095C24∶10.5800.0200.0100.0510.5500.0200.0100.0600.052C20∶4n6- - - - - - - - - - C20∶5n3- - 0.150- 0.069- 0.160- - 0.068C22∶6n3- - - - 0.370- - - - 0.370飽和脂肪酸6.76015.10015.17013.78015.3006.87015.56015.33014.34015.890不飽和脂肪酸92.56082.72083.83085.67083.06091.63083.93083.14085.24085.460

3 結(jié) 論

分別采用CD-2560色譜柱和DB-WAX色譜柱對(duì)37種脂肪酸標(biāo)樣和油樣進(jìn)行脂肪酸分離。CD-2560色譜柱和DB-WAX型色譜柱最佳分離條件為：混標(biāo)質(zhì)量濃度1 mg/mL，柱流速0.55 mL/min，分流比70∶1，程序升溫為100℃保持5 min，以3℃/min速率上升至230℃(CD-2560色譜柱保持30 min，DB-WAX色譜柱保持50 min)。采用這兩種色譜柱用于5種油樣中脂肪酸組分含量的測(cè)定，分離效果幾乎一致，說(shuō)明CD-2560色譜柱和DB-WAX色譜柱均能較好地應(yīng)用于植物油中37種脂肪酸組成的測(cè)定。