益氣溫陽(yáng)活血利水法對(duì)慢性肺源性心臟病大鼠水通道蛋白4表達(dá)的影響及機(jī)制研究①

楊 靜 馬 泉 張 元

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科，蘭州730000)

慢性肺源性心臟病 (Chronic pulmonary heart disease，CPHD )是由支氣管、肺組織、胸廓或肺血管病變致肺血管阻力增加，產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓，繼而右心室結(jié)構(gòu)或 (和)功能改變的疾病[1]。益氣溫陽(yáng)活血利水法是目前公認(rèn)的治療CPHD的有效方法之一，其理論依據(jù)在于心衰發(fā)病病機(jī)是氣虛血瘀水結(jié)而定的[2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道在CPHD患者中采用益氣溫陽(yáng)活血利水法可以顯著改善患者預(yù)后，提高心臟功能[3]。但目前關(guān)于益氣溫陽(yáng)活血利水法治療CPHD具體分子機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者指出心力衰竭水潴留機(jī)制的主要途徑為心輸血量下降-血管加壓素水平升高-腎臟集合管 V2 受體激活-水通道蛋白(AQP)激活和/或基因表達(dá)上調(diào)-水重吸收增加[4]。AQPs家族的多個(gè)成員在CPHD中均發(fā)揮重要作用，如AQP2在調(diào)節(jié)機(jī)體水液代謝中起著重要作用。但是，AQP4在心肌細(xì)胞重塑過(guò)程中作用仍不清楚，尤其是益氣溫陽(yáng)活血利水法是否通過(guò)調(diào)控AQP4改善心肌細(xì)胞重塑目前仍缺乏相關(guān)研究[5]。因此，本研究擬通過(guò)益氣溫陽(yáng)活血利水法干預(yù)CPHD大鼠，探討益氣溫陽(yáng)活血利水法對(duì)CPHD大鼠心臟功能的改善作用及與AQP4相關(guān)具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周SD大鼠48只，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，充足飲食，室溫(18～25)℃，濕度50%～80%，合格證號(hào):SYXK(X) 2018-015；AQP4、pERK1/2、ERK1/2、GAPDH購(gòu)自Abcam公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠、HRP標(biāo)記羊抗兔購(gòu)自博士德生物科技公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；其他實(shí)驗(yàn)所需試劑與實(shí)驗(yàn)設(shè)備由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2方法

1.2.1造模與分組 健康雄性SD大鼠，按無(wú)水乙醇與生理鹽水(2∶8) 混合液配成1%的MCT溶液，以60 mg/kg腹腔注射，空白組不予注射，21 d后采大鼠頸動(dòng)脈血檢測(cè)大鼠二氧化碳分壓(PaCO2)、氧分壓(PaO2)、動(dòng)脈血氧飽合度(SaO2)；采用心臟彩超檢測(cè)心率(HR)，左心室收縮率(LVSP) 、最大左室內(nèi)壓變化速率(LVdp/dtmax)顯著下降，提示大鼠CPHD模型建立成功，具體見(jiàn)表1。共45只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(Con組)、CPHD模型組(CPHD組)、實(shí)驗(yàn)組(Exp 組)3組，每組15只。Con組不予注射MCT與藥物，余與其他組無(wú)差異；CPHD組給予建模；建模成功后給予安慰劑灌胃；Exp 組按成人體重與劑量折算公式，換算成大鼠劑量給予益氣溫陽(yáng)活血利水法湯劑灌胃。

1.2.2益氣溫陽(yáng)活血利水法湯劑制備 采用具有益氣溫陽(yáng)活血利水功效的健心湯灌胃，每日1劑，水煎服，每日2次，療程為4周，按成人體重與劑量折算公式計(jì)算給藥量(60 kg/d)，大鼠給藥量=(大鼠體重/60 kg)/d。健心湯方劑為：生黃芪30 g 、太子參20 g 、熟附子10 g 、仙茅 10 g 、紅花 20 g 、川芎15 g 、葶藶子20 g 、茯苓20 g 、香附10 g 、桂枝10 g。

1.2.3標(biāo)本采集 于給藥后4周，以 10%水合氯醛(350 ml/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物，開(kāi)胸，快速取出心臟標(biāo)本，立即放置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4Western blot 按不同因素處理細(xì)胞，提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，采用5×上樣緩沖液稀釋?zhuān)褂?2%分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗10 min×3次，用5%TBST稀釋的BSA稀釋一抗，分別與膜接觸4℃孵育過(guò)夜后，用TBST漂洗10 min×3次，加二抗室溫下孵育1 h 后，用TBST 洗膜10 min×3次，在Gene Gnome曝光儀上曝光并拍照。

1.2.5qRT-PCR 獲得樣本，嚴(yán)格按照RNAgent Isolation System說(shuō)明書(shū)，抽提總RNA。取1 μg總RNA，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)在PE公司GeneAmp8 5700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，嚴(yán)格按照SYBR green說(shuō)明書(shū)加樣，總反應(yīng)體系20 μl，各樣本加cDNA 2 μl；SYBR green 10 μl；商品化引物 2 μl (AQP4:MQP046624；GAPDH:MQP027158;Genecopoeia公司，美國(guó))；RANase Rree去離子水 2 μl。按兩步法反應(yīng)94℃ 30 s，58℃ 30 s，反復(fù)40個(gè)循環(huán)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1各組心功能比較建模成功后，CPHD組大鼠 PaCO2、HR顯著高于Con組，而CPHD組PaO2、SaO2、LVSP、LVdp/dtmax顯著低于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外，Exp 組PaCO2、HR較CPHD組顯著下降，而PaO2、SaO2、LVSP、LVdp/dtmax較CPHD組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表 1。

2.2各組心肌細(xì)胞AQP4表達(dá)比較在mRNA水平，CPHD組AQP4表達(dá)顯著低于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外，Exp 組AQP4表達(dá)較CPHD組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在蛋白水平己發(fā)現(xiàn)與mRNA水平相似的結(jié)果，見(jiàn)圖 1。

表1 各組心功能比較

Tab.1 Comparison of cardiac function in each group

GroupsPaCO2HRPaO2SaO2LVSPLVdp/dtmaxCon38.67±10.8589.38±21.0687.39±18.2592.36±17.6827.83±3.961092.66±84.89CPHD49.92±11.41117.58±23.4257.53±17.7173.25±16.6421.45±4.02768.42±91.13Exp41.57±10.26104.29±22.3669.38±17.8282.49±15.3724.57±3.28861.59±88.26F3.626.0010.554.9810.7553.82P0.0350.0050.0000.0120.0000.000

圖1 各組心肌細(xì)胞AQP4表達(dá)比較Fig.1 Comparison of AQP4 expression in cardiomyocytes of each groupNote: A.Comparison of AQP4 expression at mRNA level;B，C.Comparison of AQP4 expression at protein level,**.P<0. 01.

表2 各組IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子表達(dá)比較

Tab.2 Comparison of IL-1β,IL-6,TNF-α expression in each group

GroupsIL-1βIL-6TNF-αCon24.69±7.8510.38±5.0687.39±21.25CPHD53.71±9.6219.58±3.42117.53±20.71Exp42.85±9.0314.29±5.3696.38±22.84F41.0414.627.68P0.0000.0000.001

圖2 Western blot檢測(cè)各組ERK、NF-κB表達(dá)Fig.2 Expression of ERK,NF-κB in each group detected by Western blotNote: A，B.Protein level of pERK1/2 and pNF-κB;C.Expression of pERK1/2 and pNF-κB.**.P<0.01.

2.3各組IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子表達(dá)比較在mRNA水平，CPHD組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著高于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外，Exp 組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)較CPHD組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表 2。

2.4各組ERK、NF-κB表達(dá)比較在蛋白水平，CPHD組pERK1/2、pNF-κB表達(dá)顯著高于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外，Exp 組pERK1/2、pNF-κB表達(dá)較CPHD組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖 2。

3 討論

CPHD 屬中醫(yī)“咳嗽”、“痰飲”、“ 心悸”、“ 喘證”、“肺脹”等范疇，痰瘀互阻是CPHD主要病機(jī)特點(diǎn)，且貫穿其始終[3]。CPHD病理性質(zhì)為脾腎陽(yáng)虛為本，痰濁、水飲、瘀血為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)。CPHD首先為肺脹，病變?cè)诜?，多屬積漸而成，病程纏綿，遷延不愈，導(dǎo)致肺氣脹滿(mǎn)，不能斂降，日久傷及脾腎。心脈上通與肺，肺氣輔佐心臟治理，調(diào)節(jié)心血的運(yùn)行，心陽(yáng)根于命門(mén)真火，故肺腎陽(yáng)虛，均可病及于心，心氣無(wú)力推動(dòng)血脈，則血行澀滯，可見(jiàn)唇、舌、甲紫紺等淤血之表現(xiàn)。益氣溫陽(yáng)活血利水法具有益氣通絡(luò)，活血化瘀之功效，我們的臨床研究與前期文獻(xiàn)報(bào)道己證明，益氣溫陽(yáng)活血利水法治療CHPD療效顯著，能顯著改善患者癥狀與預(yù)后。從中醫(yī)理論上講，附子、干姜屬辛熱之品，可溫腎陽(yáng)補(bǔ)脾陽(yáng)，使腎陽(yáng)得復(fù)、氣化得行，溫肺化飲。白術(shù)性甘苦而溫，燥濕健脾；附子振腎陽(yáng)于先，姜、術(shù)復(fù)脾陽(yáng)于后；川芎為“血中之氣藥”，氣行則血行，則瘀血自除。茯苓、豬苓、澤瀉健脾利濕，淡滲利水，使水氣從小便而出；丹參、赤芍助川芎活血化瘀。葶藶子瀉肺平喘利水，具有顯著的止咳平喘強(qiáng)心利尿，抗感染作用。方劑中采用上述藥物配伍合用，全方辨病與辨證相結(jié)合，標(biāo)本兼顧，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，針對(duì)性強(qiáng)共奏溫陽(yáng)化瘀利水之功[6-9]。我們?cè)诖笫驝HPD模型中進(jìn)一步證實(shí)，益氣溫陽(yáng)活血利水法能顯著改善大鼠的生化指標(biāo)，改善肺部氧和情況，提高心臟功能。

但是，目前益氣溫陽(yáng)活血利水法治療CHPD的具體分子機(jī)制尚不清楚。有研究認(rèn)為當(dāng)歸可通過(guò)降低血小板聚集和抗血栓作用，擴(kuò)張肺動(dòng)脈發(fā)揮保護(hù)心臟作用；黃芪、茯苓可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫，改善免疫狀態(tài)；但是其對(duì)于心肌細(xì)胞的作用仍缺乏相關(guān)研究[10]。AQP4 是AQP家族的重要成員，在細(xì)胞膜中以四聚體形式存在，生理情況下，水通過(guò)細(xì)胞膜包括磷脂雙層的簡(jiǎn)單擴(kuò)散和通過(guò)AQP實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)兩個(gè)過(guò)程[11]。研究表明，AQP表達(dá)與心肌細(xì)胞耐受缺血能力密切相關(guān)，缺血心肌細(xì)胞AQP表達(dá)明顯下調(diào)[12]。同時(shí)，中醫(yī)理論認(rèn)為痰濕是水液代謝失調(diào)的產(chǎn)物，與水通道蛋白關(guān)系密切[13]。因此，我們探究了益氣溫陽(yáng)活血利水法對(duì)CHPD大鼠心肌細(xì)胞AQP4表達(dá)的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)CHPD大鼠心肌細(xì)胞AQP4表達(dá)明顯減少，給予益氣溫陽(yáng)活血利水法治療后顯著升高，這一可能是該方劑治療CHPD的重要分子機(jī)制之一。

另外，越來(lái)越多證據(jù)表明機(jī)體免疫失調(diào)與CHPD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是CHPD發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制之一[14]。炎癥因子可通過(guò)介導(dǎo)肺毛細(xì)血管收縮以及通透性改變，肺纖毛細(xì)胞損傷等多種機(jī)制介導(dǎo)肺損傷，同時(shí)還能通過(guò)調(diào)控心室重構(gòu)、降低心肌收縮力等作用誘發(fā)加重心衰[15]。同時(shí)，研究認(rèn)為炎癥因子與AQP的表達(dá)密切相關(guān)，尤其是IL-6、TNF-α在調(diào)節(jié)AQP的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，介導(dǎo)AQP表達(dá)的下調(diào)。IL-6、TNF-α等被認(rèn)為是心臟的“自殺行為”因子，尤其是IL-6在心臟細(xì)胞因子分泌中發(fā)揮核心作用，誘生TNF-α等多種炎癥因子[16]。通過(guò)我們的研究證實(shí)，CHPD大鼠心肌中IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高，給予益氣溫陽(yáng)活血利水法治療后可顯著降低。

進(jìn)一步探究與IL-1β、IL-6、TNF-α合成分泌相關(guān)的ERK、NF-κB信號(hào)通路，在給予益氣溫陽(yáng)活血利水法治療后的變化發(fā)現(xiàn)，在給予益氣溫陽(yáng)活血利水法治療后，ERK、NF-κB信號(hào)通路的激活顯著下降。當(dāng)心臟受到外源性損傷后，多種損傷相關(guān)分子通過(guò)激活心肌細(xì)胞表面的如TLRs、NOD等受體，進(jìn)一步激活下游的ERK1/2信號(hào)途徑，從而激活核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使心肌細(xì)胞合成釋放炎癥因子與炎癥趨化因子[17]。目前，關(guān)于益氣溫陽(yáng)活血利水法的具體影響信號(hào)通路的研究尚較缺乏，而針對(duì)ERK1/2的研究較少。有學(xué)者報(bào)道在抑制ERK1/2的表達(dá)，并可發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用，但目前針對(duì)AQP4表達(dá)下調(diào)的機(jī)制仍缺乏[18]。通過(guò)我們的研究推測(cè)，益氣溫陽(yáng)活血利水法可以通過(guò)抑制ERK、NF-κB信號(hào)通路，減少I(mǎi)L-1β、IL-6、TNF-α的合成，從而促進(jìn)AQP4的表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，益氣溫陽(yáng)活血利水法通過(guò)抑制ERK、NF-κB信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)，上調(diào)心肌細(xì)胞AQP4表達(dá)，改善CHPD大鼠心臟功能與血液氧化情況，這可能是益氣溫陽(yáng)活血利水法治療CHPD的重要分子機(jī)制。