鹽酸小檗堿對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性腦損傷后腦組織形態(tài)學(xué)和NF-κB活性的影響①

馬 競 何文龍 高重陽 余瑞云 薛 鵬 牛永超

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新鄉(xiāng)453000)

腦損傷是由外力、細(xì)菌或藥物引起的腦組織出現(xiàn)器質(zhì)性的損傷。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分，也是抗生素應(yīng)用后產(chǎn)生的內(nèi)毒素的主要毒力因子，可刺激星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面黏附分子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分子間隙，從而使白細(xì)胞通過血腦屏障導(dǎo)致腦損傷[1]。因此，LPS常用來制作腦損傷模型。鹽酸小檗堿(Berberine Hydrochloride，BH)又稱為黃連素，是一種可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取到的季銨類化合物，屬于異喹啉生物堿[2,3]。已有研究表明鹽酸小檗堿具有降脂、降血糖、抗炎、抗菌和抗腫瘤等多種生理作用，但是其對LPS誘導(dǎo)的腦損傷的作用和機制并未見報道[4-10]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)節(jié)因子，腦損傷后它在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛高水平表達(dá)，與其調(diào)控的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子 等一起積極參與炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等生物進(jìn)程，同時NF-κB又具有神經(jīng)保護(hù)作用[11]。鹽酸小檗堿對LPS誘導(dǎo)的腦損傷中NF-κB的影響還不清楚。本文主要研究鹽酸小檗堿對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性腦損傷后腦組織形態(tài)學(xué)和NF-κB活性的影響，以期為腦損傷的治療提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所，鹽酸小檗堿購自四川升和藥業(yè)股份有限公司，LPS購自美國Sigma公司，BCA試劑盒購自北京天根生化有限公司，SOD、MDA、GSH、LDH和ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物。

1.2方法

1.2.1分組及處理方法 將SD大鼠隨機分為對照組(Control組)、模型組(LPS組)、給藥組[LPS+BH(25 mg)組，LPS+BH(50 mg)組、LPS+BH(100 mg)]組共5組，每組20只SD大鼠。給藥組：各組每天分別灌胃25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的鹽酸小檗堿，連續(xù)6 d，然后大鼠腹腔注射LPS 0.6 mg/kg，6 h 后收集材料；模型組：每天灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)6 d，然后大鼠腹腔注射LPS 0.6 mg/kg，6 h后收集材料；Control組：除注射的是生理鹽水之外，其他和模型組處理相同。

1.2.2HE染色 腦組織經(jīng)甲醛固定后，用石蠟包埋、切片；然后經(jīng)二甲苯、酒精、鹽酸乙醇、伊紅染液染色；接著經(jīng)酒精、二甲苯固定裝片；最后用顯微鏡觀察。

1.2.3Tunel染色 腦組織經(jīng)甲醛固定后，用石蠟包埋、切片；然后經(jīng)二甲苯、乙醇、Proteinase K、多聚甲醛、Equilibretion Buffer、TdT酶反應(yīng)液、SSC溶液、過氧化氫、Streptavidin HRP溶液、DAB顯色液、蘇木素復(fù)染之后，用酒精脫水、二甲苯透明；最后封片，用顯微鏡觀察。

1.2.4RT-PCR 將腦組織的總RNA提取后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測。以β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。Caspase-3的上游引物：5′-TGGACCTGTTGACCTGA-AAA-3′，Caspase-3的下游引物：5′-ACAAAGCGACTGGATGAACC-3′;Caspase-9的上游引物：5′-CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA-3′，Caspase-9的下游引物：5′-GACACCATCCAAGGTCTCGATGTA-3′。

1.2.5Western blot 取腦組織，加入RIPA 裂解液，提取蛋白質(zhì)；然后，使用 BCA試劑盒測定蛋白品濃度。取蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)入PVDF 膜，在5% 脫脂奶粉封閉30 min；接著，加入相應(yīng)的一抗溶液中，室溫條件下孵育 2 h；然后，加入 TBST 稀釋的二抗溶液，室溫孵育 1 h ；最后用ECL曝光。

1.2.6氧化應(yīng)激水平檢測 將腦組織加入生理鹽水勻漿離心后，按SOD、 MDA、 GSH和LDH試劑盒說明書分別測定SOD、MDA、 GSH和LDH含量。

1.2.7ELISA檢測 按照ELISA試劑盒說明書操作：加入蛋白、多肽和包被液混合，封閉劑封閉，再加入對應(yīng)一抗，加入二抗，最后，加入顯色液顯色，用酶標(biāo)儀檢測。

2 結(jié)果

2.1鹽酸小檗堿減輕脂多糖誘導(dǎo)的腦組織的病理損傷 通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)：Control組細(xì)胞排列整齊，形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常；LPS組細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)疏松；給藥組細(xì)胞排列較紊亂，結(jié)構(gòu)較疏松，程度比LPS組輕，特別是LPS+BH(100 mg)組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和Control組相接近(圖1)。

通過Tunel染色觀察發(fā)現(xiàn)：與Control組相比，LPS組細(xì)胞凋亡率顯著增多，說明LPS誘導(dǎo)急性腦損傷造模成功，并且LPS會誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡；與LPS組相比，給藥組細(xì)胞凋亡率顯著減少，并且隨著給藥量的增加，大鼠細(xì)胞凋亡率逐漸降低，說明鹽酸小檗堿可以減輕LPS誘導(dǎo)的腦組織病理損傷，并抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且這種減輕和抑制作用隨著給鹽酸小檗堿量的增加而增強(P<0.01，圖1)。

2.2鹽酸小檗堿抑制脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 通過RT-PCR檢測Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)情況可知：與Control組相比，LPS組Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，說明LPS誘導(dǎo)急性腦損傷造模成功，并且LPS會誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡；與LPS組相比，給藥組Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，并且隨著給藥量的增加，大鼠細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9的mRNA逐漸下調(diào)，說明鹽酸小檗堿可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且這種抑制作用隨著鹽酸小檗堿素量的增加在增強(P<0.01，圖2A)。

圖1 通過HE染色和Tunel染色觀察腦組織病理損傷(×400)Fig.1 Pathological damage of brain tissue observed by HE staining and Tunel staining(×400)Note: **.P<0.01 versus Control group；##.P<0.01 versus LPS group.

圖2 Caspase-3和Caspase-9 的mRNA和蛋白表達(dá)情況Fig.2 mRNA and protein expression of Caspase-3 and Caspase-9Note: A.The expression of Caspase-3 and Caspase-9 mRNA was detected by RT-PCR;B.The expression of Caspase-3 and Caspase-9 protein was detected by Western blot;**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus LPS group.

通過Western blot檢測Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)情況可知：與Control組相比，LPS組Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，說明LPS誘導(dǎo)急性腦損傷造模成功，并且LPS會誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡；與LPS組相比，給藥組Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，并且隨著給藥量的增加，大鼠細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9的蛋白逐漸下調(diào)，說明鹽酸小檗堿可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且這種抑制作用隨著鹽酸小檗堿素量的增加而增強(P<0.01，圖2B)。

2.3鹽酸小檗堿減緩脂多糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng) 通過試劑盒檢測SOD、 MDA、 GSH和LDH含量發(fā)現(xiàn)：與Control組相比，LPS組MDA和LDH含量顯著上升，SOD和GSH含量顯著下降，說明LPS誘導(dǎo)腦損傷造模成功；與LPS組相比，給藥組MDA和LDH含量顯著下降，SOD和GSH含量顯著上升，并且隨著給藥量的增加，大鼠細(xì)胞MDA和LDH含量逐漸下降，SOD和GSH含量逐漸上升，說明鹽酸小檗堿可以減緩脂多糖誘導(dǎo)的大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，且這種減緩力度隨著鹽酸小檗堿量的增加而增強(P<0.01，圖3)。

圖3 氧化應(yīng)激水平檢測Fig.3 Oxidative stress level detectionNote: A.The SOD content is detected by the SOD kit;B.The MDA content is detected by the MDA kit;C.The GSH content is detected by the GSH kit;D.The LDH content is detected by the LDH kit;**.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus LPS group.

2.4鹽酸小檗堿減緩脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) 通過ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6的含量發(fā)現(xiàn)：與Control組相比，LPS組TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著上升，說明LPS誘導(dǎo)腦損傷造模成功，并且LPS誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；與LPS組相比，給藥組TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著下降，并且隨著給藥量的增加，大鼠細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6含量逐漸下降，說明鹽酸小檗堿可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠炎癥反應(yīng)，且這種減輕程度隨著鹽酸小檗堿量的增加而增強(P<0.01，圖4)。

2.5鹽酸小檗堿減緩脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB P65和IκBa的表達(dá) 通過Western blot檢測NF-κB P65和IκBa的蛋白表達(dá)情況可知：與Control組相比，LPS組NF-κB P65和IκBa的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，說明LPS誘導(dǎo)急性腦損傷造模成功，并且LPS激活NF-κB；與LPS組相比，給藥組NF-κB P65和IκBa的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，并且隨著給藥量的增加，大鼠細(xì)胞NF-κB P65和IκBa的蛋白逐漸下調(diào)，說明鹽酸小檗堿可以抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的激活，且這種抑制作用隨著鹽酸小檗堿素量的增加在增強(P<0.01，圖5)。

圖4 ELISA檢測TNF-α,IL-1β,IL-6的含量Fig.4 TNF-α,IL-1β,IL-6 levels were detected by ELISANote: **.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus LPS group.

圖5 Western blot檢測NF-κB P65和IκBa的蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expression of NF-κB P65 and IκBa was detected by Western blotNote: **.P<0.01 versus Control group;##.P<0.01 versus LPS group.

3 討論

LPS誘導(dǎo)腦損傷會使血腦屏障的結(jié)構(gòu)不完整、通透性增加，而不完整的血腦屏障有利于LPS進(jìn)一步進(jìn)入腦組織造成損傷，從而形成一個惡性循環(huán)，加重腦損傷[1]。鹽酸小檗堿是用于治療胃腸炎、細(xì)菌性痢疾等腸道感染、眼結(jié)膜炎、化膿性中耳炎等疾病的常用藥物[2]，并已有文獻(xiàn)報道鹽酸小檗堿還具有降脂、降血糖、抗菌和抗腫瘤等多種生理作用，但是其對LPS誘導(dǎo)的腦損傷的作用和機制并未見報道。本研究通過HE染色和Tunel染色發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能夠使LPS誘導(dǎo)的損傷組織恢復(fù)正常形態(tài)，并顯著減少LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，這些結(jié)果表明鹽酸小檗堿呈劑量依賴性減輕LPS誘導(dǎo)的腦組織病理損傷。

腦損傷會導(dǎo)致腦細(xì)胞的凋亡，抑制腦細(xì)胞的凋亡可達(dá)到保護(hù)腦免受損傷的目的。如，Chien等[12]研究發(fā)現(xiàn)丹參酚酸A通過抑制小鼠炎癥和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，減輕缺血性腦損傷。鹽酸小檗堿對細(xì)胞的凋亡的作用各不相同：Wang等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能夠抑制人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)CNE-1細(xì)胞凋亡 ；Li等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Choi等[15]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能夠通過抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的積累來減弱H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞C2C12的細(xì)胞凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿呈劑量依賴性減少LPS誘導(dǎo)大鼠的細(xì)胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)量，這說明鹽酸小檗堿呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

腦組織對氧化應(yīng)激反應(yīng)非常敏感，抑制機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)有助于保護(hù)腦組織。如，Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)苦柯胺A通過抑制氧化應(yīng)激對輻射誘導(dǎo)的大鼠腦損傷的神經(jīng)起保護(hù)作用。已有Choi等[15]報道鹽酸小檗堿通過誘導(dǎo)nrf-2介導(dǎo)的HO-1表達(dá)來保護(hù)成肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷。因此，鹽酸小檗堿有望抑制LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿呈劑量依賴性降低LPS誘導(dǎo)的MDA和LDH含量，并升高LPS誘導(dǎo)的SOD和GSH含量，這說明鹽酸小檗堿呈劑量依賴性減緩LPS誘導(dǎo)的大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)。

炎癥是腦損傷病理生理過程中一個重要的組成環(huán)節(jié)，抑制炎癥有助于保護(hù)腦組織免受損傷。如，Tian等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)富氫水可減輕大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后的炎癥緩解腦損傷。鹽酸小檗堿能夠顯著抑制炎癥：Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可顯著減輕中性粒細(xì)胞浸潤，并在一定范圍內(nèi)劑量依賴性地降低TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。因此，鹽酸小檗堿有望抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿呈劑量依賴性降低TNF-α、IL-1β、IL-6含量，這說明鹽酸小檗堿呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠炎癥。

鹽酸小檗堿能夠顯著抑制NF-κB P65和IκBa的表達(dá)：Zhang等[3]通過研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿抑制腹部手術(shù)后TAK1/JNK和TAK1/NF-κB信號傳導(dǎo)來減輕炎癥。因此，鹽酸小檗堿有望抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的激活。本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿呈劑量依賴性下調(diào)NF-κB P65和IκBa的蛋白表達(dá)，說明鹽酸小檗堿呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的激活。

綜上所述，鹽酸小檗堿呈劑量依賴性減輕LPS誘導(dǎo)的腦組織病理損傷，并抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和NF-κB的激活，從而抑制LPS誘導(dǎo)的腦損傷。這為鹽酸小檗堿開發(fā)利用提供新數(shù)據(jù)，為腦損傷預(yù)防治療奠定基礎(chǔ)。