miR-369-3p靶向MMP14調(diào)節(jié)乳頭狀甲狀腺癌細胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用①

王小清 王金蓮 林 帥 侯令密 謝少利 青 曉

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，南充637000)

乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid cancer,PTC)在所有甲狀腺腫瘤中最為常見，所占比例大約85%～90%[1]，該腫瘤疾病目前的主要治療方法是手術(shù)切除，具有較高的術(shù)后治愈率和生存率，然而對甲狀腺癌的手術(shù)治療會損害患者甲狀腺功能，導致鈣代謝紊亂、喉神經(jīng)損傷等疾病發(fā)生[2]，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。因此，尋找副作用低的可替代療法對于改善PTC患者治療后的生活質(zhì)量具有重要意義。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrix metalloproteinase,MMP)在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[3]。其中MMP14定位于質(zhì)膜，參與了組織生長發(fā)育和血管生成等生理過程[4,5]，該酶可激活MMP2蛋白表達，從而提高腫瘤細胞的侵襲能力[6]。研究表明MMP14參與了多種腫瘤細胞的生長與擴散過程，證實了MMP14表達與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展的相關性，因此，MMP14具有作為臨床上癌癥診斷檢測指標以及基因靶向治療位點的潛力[7-10]。

MicroRNA(miRNA)是一類長度約22 nt的小分子非編碼RNA，可通過與mRNA 3′UTR結(jié)合沉默目的基因，在癌癥中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[11]。miR-369-3p已被報道在PTC中可以抑制腫瘤細胞增殖[12]。通過生物信息學預測，MMP14很可能是miR-369-3p的作用靶點之一，本研究通過培養(yǎng)人乳頭狀甲狀腺癌B-CPAP細胞，并通過miR-369-3p mimic處理及構(gòu)建MMP14過表達細胞株，初步探究了miR-369-3p在PTC細胞中與MMP14的相互作用及調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 RPMI1640細胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，Trizol試劑、RIPA裂解液、BCA試劑盒、Ecl顯色液購自北京索萊寶生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒購自美國Bio-rad公司，Taqman miRNA RT 試劑盒、Taqman universal master mix試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司，MMP14、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Twist、上皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(Extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、MMP2、GAPDH抗體購自Abcam公司，重組慢病毒顆粒、miR-369-3p mimic和陰性對照mimic均由受上海漢恒生物科技公司合成，實驗用到的引物采用Primer3 Input網(wǎng)站設計，由華大基因合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人乳頭狀甲狀腺癌細胞株B-CPAP購自ATCC公司，采用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640細胞培養(yǎng)液，5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換一次液。

1.2.2細胞分組及處理方法 將B-CPAP細胞分為B-CPAP組、mimic-NC組、miR-369-3p mimic組、pLV-MMP14組、mimic+pLV-MMP14組，其中B-CPAP組作為空白對照，mimic-NC組和miR-369-3p mimic組按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別轉(zhuǎn)染陰性對照mimic(mimic-NC)和miR-369-3p mimic。MMP14重組慢病毒顆粒感染pLV-MMP14組和mimic+pLV-MMP14組細胞，其中mimic+pLV-MMP14組進一步轉(zhuǎn)染miR-369-3p。轉(zhuǎn)染進行48 h后用于后續(xù)檢測。

1.2.3病毒感染B-CPAP細胞 處于對數(shù)生長期的B-CPAP細胞接種于6孔板，每孔細胞數(shù)約5×104個，待細胞生長至鋪滿板底70%空間時，使用含1×108TU/ml MMP14重組慢病毒顆粒病毒液感染B-CPAP細胞，每孔10 μl。24 h后換成新鮮完全培養(yǎng)液37℃繼續(xù)培養(yǎng)，感染后48 h，加入終濃度2 μg/ml的Puromycin，2～3 d換一次液。

1.2.4RT-PCR檢測mRNA表達水平 根據(jù)1.2.2所述的方法分組和處理細胞后，Trizol提取各組細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行PCR反應，循環(huán)條件：預變性95℃ 10 min，變性95℃ 15 s，退火60℃ 1 min，循環(huán)次數(shù)40次。SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒檢測mRNA水平，2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.5熒光素酶報告實驗檢測 通過生物信息學數(shù)據(jù)庫Targetscan預測miR-369-3p和MMP14基因的靶向作用關系，分別構(gòu)建MMP14 Lenti-reporter-luciferase野生型和突變型載體，將細胞分為MMP14 WT、MMP14 WT+miR-369-3p mimic、MMP14 MUT、MMP14 MUT+miR-369-3p mimic四組，24孔板放置1 d，野生型和pRL-CMV載體共轉(zhuǎn)染MMP14 WT和MMP14 WT+miR-369-3p mimic組，突變型載體和pRL-CMV載體共轉(zhuǎn)染MMP14 MUT和MMP14 MUT+miR-369-3p組，miR-369-3p mimic分別轉(zhuǎn)染MMP14 WT+miR-369-3p mimic和MMP14 MUT+miR-369-3p mimic組，轉(zhuǎn)染48 h后使用熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.2.6Transwell法檢測細胞侵襲 50 μl 基質(zhì)膠加入Transwell小室中，37℃凝固3 h，上室和下室分別加入無血清培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基，按1.2.2所述的方法分組和處理細胞后，接種于Transwell小室上室，培養(yǎng)48 h后取出小室并擦除未通過膜的細胞，剩下的細胞使用多聚甲醛固定，1% 結(jié)晶紫染色拍照。

1.2.7劃痕法檢測細胞遷移 按1.2.2所述的方法分組和處理細胞后，接種于6孔板，細胞長滿80%時使用中等槍頭垂直水平劃線，PBS反復清洗3次，5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出拍照。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達水平 按1.2.2所述方法分組和處理細胞，RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA定量，每組取30 μg蛋白通過SDS-PAGE (10%)進行分離，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4℃孵育過夜。TBST反復沖洗3次，加入二抗孵育2 h，二抗孵育完畢，通過TBST清洗三次，ECL顯色液顯影，GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1miR-369-3p抑制PTC細胞MMP14的基因表達 如圖1A所示，與B-CPAP組比較，miR-369-3p mimic組miR-369-3p表達水平顯著升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義，mimic-NC組miR-369-3p表達水平無顯著差異，表明miR-369-3p成功轉(zhuǎn)染了B-CPAP細胞；同時，miR-369-3p mimic組中MMP14 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，mimic-NC組MMP14 mRNA表達水平無顯著差異，見圖1B。結(jié)果表明miR-369-3p和MMP14的基因表達存在相互關聯(lián)。

2.2miR-369-3p靶向作用于MMP14基因抑制其蛋白表達 如圖2A所示，與MMP14 WT組比較，MMP14 WT+miR-369-3p mimic組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；MMP14 MUT組與MMP14MUT+miR-369-3p mimic組均無顯著差異。同時，與B-CPAP比較，miR-369-3p組MMP14蛋白表達水平顯著降低，pLV-MMP14組MMP14蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與pLV-MMP14組比較， mimic+pLV-MMP14組MMP14蛋白表達水平顯著降低，但仍高于miR-369-3p mimic組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明miR-369-3p可通過靶向作用于MMP14基因，抑制MMP14的蛋白表達。

圖1 miR-369-3p對B-CPAP細胞MMP14基因表達水平的影響Fig.1 Effects of miR-369-3p on gene expression level of MMP14 in B-CPAP cellNote: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group.

圖2 熒光素酶報告實驗檢測miR-369-3p與MMP14的靶向作用Fig.2 Luciferase reporter assay was performed for measuring targeting relationship between miR-369-3p and MMP14Note: n=6,**.P<0.01 versus MMP14 WT or miR-369-3p mimic group;##.P<0.01 versus miR-369-3p and pLV-MMP14 group.

2.3miR-369-3p靶向作用于MMP14抑制PTC細胞的侵襲能力 如圖3所示，與B-CPAP組比較，miR-369-3p mimic組侵襲細胞數(shù)量顯著降低，pLV-MMP14組侵襲細胞數(shù)量顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與pLV-MMP14組比較，mimic+pLV-MMP14組侵襲細胞數(shù)量顯著降低，但仍高于miR-369-3p mimic組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明，miR-369-3p對MMP14的靶向作用可抑制PTC細胞的侵襲能力。

2.4miR-369-3p靶向作用于MMP14抑制PTC細胞的遷移能力 如圖4所示，與B-CPAP組比較，miR-369-3p mimic組劃痕愈合率顯著降低，pLV-MMP14組劃痕愈合率顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與pLV-MMP14組比較，mimic+pLV-MMP14組劃痕愈合率顯著降低，但仍高于miR-369-3p mimic組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明，miR-369-3p對MMP14的靶向作用可抑制PTC細胞的遷移能力。

2.5miR-369-3p靶向作用于MMP14調(diào)控EMT相關蛋白的表達 如圖5所示，與B-CPAP組比較，miR-369-3p mimic組E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，N-cadherin、Vimentin、Twist蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，pLV-MMP14組E-cadherin蛋白表達水平顯著降低，N-cadherin、Vimentin、Twist蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與pLV-MMP14組比較，mimic+pLV-MMP14組E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，但仍低于miR-369-3p mimic組(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin、Twist蛋白表達水平顯著降低，但仍高于miR-369-3p mimic組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明miR-369-3p靶向作用于MMP14，可降低PTC細胞EMT水平。

圖3 MMP14和miR-369-3p對B-CPAP細胞侵襲能力的影響(×400)Fig.3 Effects of MMP14 and miR-369-3p on invasion ability of B-CPAP cell(×400)Note: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group;##.P<0.01 versus miR-369-3p mimic and pLV-MMP14 group.

2.6miR-369-3p靶向作用于MMP14調(diào)控EGFR-ERK信號通路相關蛋白表達 如圖6所示，與B-CPAP組比較，miR-369-3p mimic組EGFR、p-ERK1/2、VEGF、MMP2蛋白表達水平顯著降低，pLV-MMP14組EGFR、p-ERK1/2、VEGF、MMP2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與pLV-MMP14組比較，mimic+pLV-MMP14組EGFR、p-ERK1/2、VEGF、MMP2蛋白表達水平顯著降低，但仍高于miR-369-3p mimic組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明miR-369-3p靶向作用于MMP14，對PTC細胞侵襲和遷移的調(diào)控機制可能與EGFR-ERK信號通路有關。

圖4 MMP14和miR-369-3p對B-CPAP細胞遷移能力的影響(×200)Fig.4 Effects of MMP14 and miR-369-3p on migration ability of B-CPAP cell(×200)Note: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group;##.P<0.01 versus miR-369-3p mimic and pLV-MMP14 group.

圖5 MMP14和miR-369-3p對EMT相關蛋白表達的影響Fig.5 Effects of MMP14 and miR-369-3p on EMT related protein expressionNote: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group;##.P<0.01 versus miR-369-3p mimic and pLV-MMP14 group.

圖6 MMP14和miR-369-3p對EGFR-ERK信號通路表達的影響Fig.6 Effects of MMP14 and miR-369-3p on EGFR-ERK signal pathway related protein expressionNote: n=6,**.P<0.01 versus B-CPAP group;##.P<0.01 versus miR-369-3p mimic and pLV-MMP14 group.

3 討論

癌癥是危害人類健康的最嚴重疾病之一，其最重要的生物學特征之一是侵襲和轉(zhuǎn)移能力，是癌癥引起患者死亡及術(shù)后復發(fā)的主要原因。MMP家族蛋白酶在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色，該家族成員主要通過破壞細胞外基質(zhì)，促使腫瘤細胞能夠入侵到周圍組織當中[13]。MMP14是MMP家族的成員之一，是一種定位于質(zhì)膜的MMP蛋白酶，研究表明該酶在多種癌癥中都發(fā)揮了重要的作用，因此，MMP14具有作為新的靶向治療位點的潛力。

本實驗室前期研究通過生物信息學預測，發(fā)現(xiàn)miR-369-3p可能與MMP14存在靶向作用關系，MMP14在腫瘤細胞的侵襲和遷移過程中發(fā)揮著關鍵作用。當MMP14經(jīng)過反式高爾基體網(wǎng)絡運輸?shù)郊毎砻婧螅纱龠M諸如MMP2等前體的激活，進而增強了細胞外基質(zhì)的降解，促進癌細胞的侵襲作用；同時MMP14還可與細胞表面跨膜糖蛋白CD44結(jié)合，參與了細胞偽足的形成，與癌細胞的運動過程有關[14]。本研究推測miR-369-3p可能通過作用于MMP14，進而抑制PTC細胞的侵襲和遷移。為了驗證這一推測，本文首先檢測了miR-369-3p mimic處理下B-CPAP細胞的MMP14基因和蛋白表達水平，研究發(fā)現(xiàn)miR-369-3p顯著降低了MMP14的基因和蛋白表達水平。進一步本文通過熒光素酶報告檢測了miR-369-3p和MMP14的靶向作用關系，發(fā)現(xiàn)miR-369-3p與MMP14存在靶向作用關系，表明miR-369-3p在PTC細胞中可靶向作用于MMP14基因，抑制MMP14基因的表達。為了探究miR-369-3p靶向作用MMP14基因?qū)TC細胞侵襲和遷移的影響，本文對細胞侵襲和遷移能力進行了檢測，發(fā)現(xiàn)miR-369-3p顯著抑制了B-CPAP細胞的侵襲和遷移能力，而MMP14的過表達可逆轉(zhuǎn)miR-369-3p的這一作用。以上實驗結(jié)果表明，miR-369-3p可通過靶向作用于MMP14，抑制PTC細胞的侵襲和遷移。

在腫瘤細胞的侵襲和遷移中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)揮著關鍵作用，通過EMT，腫瘤細胞失去自身的上皮分化特性，包括細胞黏附和極性，并獲得了間葉細胞的特性，包括遷移性、侵襲性以及一些干細胞的特征[15]，EMT的分子機制非常復雜，其中Twist是調(diào)控EMT的關鍵因子[16,17]，Alexander等[18]在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Twist可以誘導N-cadherin表達，同時抑制E-cadherin表達[19]。E-cadherin在正常上皮組織中具有維持細胞間緊密連接、限制細胞運動和轉(zhuǎn)移的作用，N-cadherin主要分布于神經(jīng)及內(nèi)皮細胞間葉組織中，其作用與細胞運動和侵襲能力相關[20]。此外，Twist還可促進Vimentin的表達[21]，Vimentin是間質(zhì)細胞中的中間纖維，與微絲和微管共同構(gòu)成了細胞支架網(wǎng)絡[22]。已有文獻報道了MMP14在諸如卵巢癌等腫瘤細胞中對EMT的促進作用[23,24]，本研究發(fā)現(xiàn)在PTC細胞B-CPAP中，MMP14過表達可顯著降低E-cadherin的表達，促進N-cadherin、Vimentin、Twist的表達，miR-369-3p可降低MMP14對E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist的調(diào)控作用，表明MMP14可促進EMT，miR-369-3p可通過抑制MMP14的表達降低EMT水平，進而抑制PTC細胞的侵襲和遷移。

在前人的研究中，Overland等[25]報道了一種全新的EGFR反式激活機制，MMP14作為G蛋白的效應器，可被活化的G蛋白直接激活，MMP14促進肝素結(jié)合類表皮生長因子(Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF)的釋放進而激活EGFR的活性。EGFR信號級聯(lián)放大是誘導EMT和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的關鍵信號通路，可通過ERK1/2信號途徑誘導EMT[26,27]。研究表明，ERK1/2可上調(diào)MMP-2蛋白酶的表達，MMP-2具有降解基底膜膠原的能力，是腫瘤轉(zhuǎn)移不可缺少的組分[28]。此外，EGFR還可以通過MAPK和PI3K等信號級聯(lián)調(diào)控VEGF表達，VEGF對腫瘤血管生成具有關鍵性作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP14過表達可顯著提高EGFR-ERK信號通路中EGFR、p-ERK1/2、VEGF和MMP2的蛋白表達水平，miR-369-3p可抑制MMP14誘導的EGFR、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2蛋白表達，表明MMP14通過調(diào)控EGFR-ERK信號通路，促進了腫瘤細胞的侵襲和遷移，miR-369-3p可抑制MMP14的表達從而阻斷EGFR-ERK通路，進而降低腫瘤細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，MMP14能夠通過誘導EMT提高PTC細胞的侵襲和遷移，其機制與EGFR-ERK信號通路相關。miR-369-3p可靶向作用于MMP14，降低MMP14表達水平，從而抑制EGFR-ERK信號通路，阻礙EMT進程，抑制PTC細胞的侵襲和遷移，為PTC治療提供了新的靶向治療分子。后期計劃構(gòu)建PTC荷瘤小鼠模型，進一步研究miR-369-3p對PTC荷瘤小鼠腫瘤生長、侵襲和遷移的影響。