靶向熒光二氧化硅納米粒子檢測模型循環(huán)腫瘤細胞的實驗研究

房慧穎，蔣偉，何曉靜，曾曉華

1.重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院/重慶市腫瘤研究所乳腺科，重慶 400030；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院放射科，重慶 400010；*通訊作者 蔣偉 305115593@qq.com

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）指存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱。CTC是目前公認的腫瘤轉移的先導標志，可作為腫瘤分期的重要判定標準[1]和病情是否改善的標志[2]。然而，CTC在腫瘤患者外周血中的數(shù)量非常稀少，特別是在早期階段，該范圍可以是 109個血細胞中僅含 1～100個CTC[3]，故CTC研究的關鍵在于能否在復雜環(huán)境中高效、迅速、準確地富集和檢測CTC[4]。

納米材料由于其獨特的功能以及較少的副作用而廣泛用于各種生物醫(yī)學領域，如生物分析、疾病診斷和治療等[5-6]。其中熒光染料摻雜的納米材料比單一染料分子擁有更高熒光的特性及易于靶向修飾的特點，越來越多地運用于 CTC的檢測及富集。本研究擬選用乳腺癌MCF-7細胞作為模型CTC，表面的上皮細胞黏附分子（EpCAM）作為靶點；使用由于抗體修飾而具有膠體穩(wěn)定性的帶負電荷的聚乙二醇化的高亮熒光二氧化硅納米粒子（nanoparticles，NPs）作為生物傳感器，用于特異性靶向EpCAM標記物，為實時監(jiān)測循環(huán)腫瘤細胞、評估治療效果，實現(xiàn)實時個體治療奠定理論基礎[7]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器癌癥治療的發(fā)展前景是迫切需要微創(chuàng)生物標志物，以促進早期發(fā)現(xiàn)曲拉通（TX-100）、正己醇和環(huán)己烷購自美國 Alfa Aesar公司。原硅酸四乙酯（TEOS）、3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTES），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和2-N-嗎啉代乙磺酸（MES）購自美國Sigma公司。丙酮、無水乙醇（99.5%）和氨水溶液（25%～28%）購自中國阿拉丁公司。Cy5.5-NHS購自美國 Lumiprobe公司。細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS）及胰蛋白酶購自武漢博士德生物技術有限公司。anti-EpCAM（兔單克隆抗體）抗體、羊抗兔IgG和羊抗兔IgG H＆L（FITC）由英國Abcam公司提供。去離子水由美國Millipore公司的Milli-Q系統(tǒng)提供。所有化學試劑均為試劑級，并且未經進一步處理即可使用。

透射電子顯微鏡（荷蘭Philips公司），激光粒徑儀（英國Malvern Instruments公司），傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，美國Thermo Fisher Scientific公司），紫外/可見光光譜儀及熒光光譜儀（日本Shimadzu公司）；激光共聚焦顯微鏡（CLSM，日本Nikon公司）、流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）。

1.2 實驗步驟

1.2.1 摻雜 Cy5.5的二氧化硅（Cy5.5@SiO2）的制備采用反相微乳液法合成熒光二氧化硅（Cy5.5@SiO2）[8]。首先將1 mg Cy5.5-NHS溶解于1 ml DMSO中，再加入10 μl APTES，避光搖晃12 h，即得Cy5.5-APTES備用。將1.77 ml TX-100、7.5 ml環(huán)己烷、1.8 ml正己醇加入燒杯中，在室溫下攪拌20 min，然后將400 μl水、100 μl TEOS 和 150 μl Cy5.5-APTES 溶液加入混合物中，在室溫下避光攪拌30 min，加入100 μl氨水溶液（25%～28%），磁力攪拌24 h，加入丙酮進行破乳，將混合物離心并用丙酮及無水乙醇各分別洗滌3次，再加入30 ml無水乙醇（60℃，12 h）中攪拌除去表面活性劑，并且離心樣品以獲得熒光NPs。將合成的熒光NPs凍干備用。

1.2.2 PEG 修飾的熒光二氧化硅的制備（Cy5.5@SiO2-PEG-COOH） 避光常溫下，將上述制備的熒光二氧化硅NPs重懸于30 ml無水乙醇溶液，超聲分散30 min，再加入硅烷PEG羧基（Saline-PEGCOOH）30 mg，磁力攪拌12 h，離心并分別用無水乙醇及雙蒸水各超聲洗滌2次，即得PEG修飾的熒光二氧化硅NPs（Cy5.5@SiO2-PEG-COOH）。

1.2.3 靶向修飾的熒光二氧化硅的制備（Cy5.5@SiO2-PEG-Ab） 避光常溫下，將Cy5.5@SiO2-PEG-COOH NPs重懸于2 ml MES緩沖液中（pH 5.0），超聲分散30 min后再加入NHS 20 mg、EDC 10 mg，搖晃 1 h，離心后得羧基活化的Cy5.5@SiO2-PEG-COOH NPs；將活化的NPs重懸于2 ml MES溶液（pH 8.0）中，超聲分散30 min，加入30 μl抗EpCAM抗體（Ab），4℃搖晃過夜，離心并PBS超聲洗滌3次，即得PEG修飾的靶向熒光二氧化硅NPs（Cy5.5@SiO2-PEG-Ab）。

1.3 合成的NPs基本理化性質檢測

1.3.1 NPs粒徑、分布等檢測 采用透射電子顯微鏡、動態(tài)光散射技術（DLS）觀察制備的熒光NPs的粒徑大小、形態(tài)、分布情況。

1.3.2 PEG修飾及Cy5.5摻雜的檢測 采用FTIR檢測 PEG是否成功連接于熒光二氧化硅表面；采用紫外光譜、熒光光譜技術檢測確定Cy5.5是否成功摻雜于二氧化硅及摻雜Cy5.5后熒光NPs的熒光性質。

1.3.3 NPs與anti-EpCAM抗體共價偶聯(lián)的檢測 將20 μl FITC標記的羊抗兔IgG H&L加入2 ml含有10 mg Cy5.5@SiO2-PEG-Ab的PBS溶液中，避光4℃攪拌1 h，將NPs離心并用去離子水洗滌3次以除去未結合的FITC。以相同的方式獲得封閉組；除在加入FITC標記的羊抗兔IgG H&L之前加入羊抗兔IgG抗體以阻斷Anti-EpCAM單抗。采用CLSM觀察二氧化硅納米表面Anti-EpCAM抗體連接情況。

1.4 Cy5.5@SiO2-PEG-Ab的細胞毒性檢測 細胞培養(yǎng)：人乳腺癌細胞系（MCF-7）（由重慶醫(yī)科大學提供）在37℃、5% CO2下，在含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中孵育。對于所有實驗，使用胰蛋白酶溶液在細胞指數(shù)生長期收集細胞，然后在鋪板前將其重懸于新鮮培養(yǎng)基中。

將乳腺癌MCF-7細胞接種于96孔板中（1×105個細胞/孔），常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后加入不同濃度的Cy5.5@SiO2-PEG-Ab（PBS作對照）（終濃度：50、100、200、400），孵育24 h后，加入CCK8 10 μl，繼續(xù)孵育1.5 h，于450 nm波長處測OD值。

1.5 Cy5.5@SiO2-PEG-Ab NPs檢測模型循環(huán)腫瘤細胞 CLSM檢測：將乳腺癌MCF-7細胞在37℃、5%CO2下孵育24 h后，除去上清液，避光下將靶向NPs Cy5.5@SiO2-PEG-Ab及非靶向 NPs Cy5.5@SiO2-PEG-COOH（0.5 ml，5.0 mg/ml）各自加入相應共聚焦培養(yǎng)皿，溫育1 h，用PBS洗滌細胞3次，除去多余的熒光NPs；再用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，用冰PBS洗滌3次，最后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染細胞核3 min。通過CLSM觀察細胞靶向情況。

流式細胞術檢測：將乳腺癌 MCF-7細胞接種于6孔板中（2×105個細胞/孔），除細胞不進行DAPI染色外，其余操作步驟與上述方法相同。用胰蛋白酶消化細胞，用 PBS洗滌 3次并重懸于 PBS中。通過FACScan流式細胞儀測量每組的平均熒光強度（MFI），以未處理的細胞作為空白對照。

1.6 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用配對樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熒光二氧化硅納米顆?；纠砘再| 透射電子顯微鏡顯示合成的 Cy5.5@SiO2和 Cy5.5@SiO2-PEG-Ab NPs呈球形，具有相對均一的尺寸分布（圖1A、B）；通過DLS測量的Cy5.5@SiO2和Cy5.5@SiO2-PEG-Ab NPs平均粒度分別為（107.01±5.75）nm 和（128.52±4.10）nm（圖2A、B），平均zeta電位分別為（-38.37±4.21）mV 和（-27.51±3.81）mV（表1）。

圖1 透射電子顯微鏡顯示合成的 Cy5.5@SiO2（A）和Cy5.5@SiO2-PEG-Ab（B）NPs呈球形，具有相對均一的尺寸分布

圖2 Cy5.5@SiO2（A）及Cy5.5@SiO2-PEG-Ab（B）粒徑分布

表1 制備的各種NPs的粒徑及電位（±s，n=3）

表1 制備的各種NPs的粒徑及電位（±s，n=3）

注：NPs為納米粒子

樣品 粒徑（nm）PDI zeta電位（mV）Cy5.5@SiO2 107.01±5.75 0.218 -38.37±4.21 Cy5.5@SiO2-PEG-COOH 117.23±4.810.301-29.13±3.50 Cy5.5@SiO2-PEG-Ab 128.52±4.10 0.126 -27.51±3.81

如圖3所示，Cy5.5@SiO2及Cy5.5@SiO2-PEGCOOH的FTIR光譜在1100 cm-1處顯示出對應于Si-O-Si振動的峰值，798 cm-1和470 cm-1左右為SiO2的特征峰，表明上述兩種NPs均為SiO2結構；1710 cm-1處的峰值對應于羧基的C=O伸縮振動峰；2910 cm-1處的峰對應于PEG中的CH烷基拉伸峰[9]，表明PEGCOOH基團成功引入Cy5.5@SiO2NPs的表面。

圖3 Cy5.5@SiO2及Cy5.5@SiO2-PEG-COOH NPs的FTIR圖

純Cy5.5染料及Cy5.5@SiO2-PEG-Ab的紫外吸收光譜圖所示，兩條曲線均在677 nm左右處出現(xiàn)吸收峰（圖4A）；同時其熒光曲線顯示其發(fā)射峰保持不變（圖4B）。

圖4 Cy5.5及Cy5.5@SiO2-PEG-Ab紫外/可見光光譜（A）及熒光光譜（B）

通過CLSM證實Cy5.5@SiO2-PEG-COOH NPs與anti-EpCAM的綴合情況。由于FITC標記的山羊抗兔抗體的特異性結合，Cy5.5@SiO2-PEG-Ab NPs顯示出強烈的紅色及綠色熒光，而封閉組由于Anti-EpCAM抗體被山羊抗兔 IgG抗體阻斷而未檢測到明顯綠色熒光（圖5）。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察靶向納米粒與Anti-EpCAM抗體的連接情況

2.2 細胞毒性實驗 乳腺癌MCF-7細胞與不同濃度的各種NPs共孵育24 h后，其存活率均大于90%，表明細胞增殖在測試濃度范圍內未受明顯影響（圖6）。

圖6 制備的NPs不同濃度下與MCF-7細胞共孵育24 h后的細胞存活率

2.3 模型循環(huán)腫瘤細胞檢測 CLSM 觀察 NPs與MCF-7細胞的成像情況見圖7。靶向組及非靶向組MCF-7細胞核均標記為藍色；Cy5.5@SiO2-PEG-Ab與MCF-7細胞結合觀察到高亮的紅色熒光信號，而在非靶向組 MCF-7細胞上僅單個細胞膜顯示少量紅色熒光，這可能是由于靜電吸附或缺乏足夠的漂洗未完全去除多余的 NPs所致，結果表明 Cy5.5@SiO2-PEGAb與細胞結合是由于受體介導的免疫反應所致。因此，Cy5.5@SiO2-PEG-Ab NPs在細胞靶向中顯示出高度特異性。

圖7 CLSM觀察NPs靶向MCF-7細胞的能力。藍色標記細胞核，紅色為Cy5.5@SiO2-PEG-Ab NPs

流式細胞術分析結果顯示，Cy5.5@SiO2-PEG-Ab及Cy5.5@SiO2-PEG-COOH與MCF-7細胞結合率分別為99.76%、8.80%（圖8），由于Cy5.5@SiO2-PEGCOOH NPs無靶向修飾，其非特異性結合非常低。

圖8 流式細胞術觀察NPs靶向MCF-7細胞的能力。A為Cy5.5@SiO2-PEG-Ab NPs與MCF-7細胞結合率，B為Cy5.5@SiO2-PEG-COOH NPs與MCF-7細胞結合率

3 討論

癌癥治療的發(fā)展前景是迫切需要微創(chuàng)生物標志物，以促進早期發(fā)現(xiàn)及對治療是否獲益的預測，以實現(xiàn)高度可靠的實時精確治療[10]。但是在臨床工作中連續(xù)活檢通常是不切實際的，而CTC可以從微創(chuàng)抽血或“液體活組織檢查”中連續(xù)獲得，能及時反映原發(fā)腫瘤的轉移情況、輔助判斷病情的進展[11]。目前CTC檢測常見的方法有流式細胞分選、免疫磁性分離、稀有細胞自動檢測系統(tǒng)等。而基于NPs檢測技術捕獲和分離CTC的方法近年備受重視。熒光染料摻雜入生物相容的NPs中不僅可以防止染料發(fā)生光漂白，而且與單一有機染料分子相比，熒光NPs具有更亮的熒光能力，可以顯著提高檢測極限及靈敏度[12-13]；并且可與適用于商業(yè)染料的實驗室儀器的典型光譜響應完美匹配。在常用NPs中，二氧化硅NPs由于它們的可調尺寸、易分離、生物相容性、合適的表面結構以及易修飾與靶向配體結合[14-15]等特點而得到廣泛關注，這種特性使其成為檢測和富集CTC的理想納米材料。另外，區(qū)分 CTC和血細胞的一種方法是其表面標記物不同。由于實體腫瘤大多起源于上皮細胞，CTC表面高表達EpCAM特異抗原（由314個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白），而在血細胞表面不表達，因此是理想的靶點。

本研究采用反相微乳液法成功制備出Cy5.5摻雜的二氧化硅熒光 NPs，進一步對熒光 NPs表面進行PEG及抗EpCAM抗體修飾；NPs表面改性后，所得的NPs形態(tài)未發(fā)生明顯變化，表明將抗EpCAM抗體連接到Cy5.5@SiO2不會改變母體材料的結構。此外，Cy5.5@SiO2-PEG-Ab的馬爾文粒徑比Cy5.5@SiO2的粒徑更大（P=0.006），其可能原因是由于PEG和抗體附著于NPs表面所致[16]。使用NPs進行靶細胞成像的難點之一是要防止NPs和細胞間的高度非特異性相互作用。本研究中制備的NPs帶負電荷，這對于防止非特異性結合并允許特異性抗體-抗原相互作用非常重要。為了減少這種非特異性結合，除通過制備帶負電荷的NPs，其表面進行PEG修飾也非常重要；由于減少了引起內吞作用的調理素和蛋白質在NPs表面聚集，PEG已被用于增加NPs的體內循環(huán)時間[13,17]。紫外/可見光光譜及熒光光譜顯示純Cy5.5@SiO2-PEG-Ab與 Cy5.5的吸收峰及熒光發(fā)射峰未見明顯變化，提示Cy5.5染料分子成功摻雜到二氧化硅NPs中，并且保留了其原有的熒光性質，這可能主要是由于二氧化硅對光學性質具有透明性，即二氧化硅不會影響原有的光學性能[18]。CLSM 及流式細胞檢測結果表明Cy5.5@SiO2-PEG-Ab NPs對模型循環(huán)腫瘤細胞MCF-7細胞具有高度特異性，與Tiernan等[19]使用NIR-664摻雜的二氧化硅NPs來靶向結腸直腸癌細胞的結果一致。此外，非靶向組細胞的熒光亮度非常低，這有利于區(qū)分陽性和陰性群體，并且?guī)缀醪粫霈F(xiàn)錯誤識別。這種低度非特異性結合歸因于許多因素，特別是zeta電位、NPs的聚乙二醇化等因素[13]，這些特性為進一步研究提供了保證。

本研究成功制備了PEG修飾的Cy5.5摻雜的二氧化硅NPs，并用來標記EpCAM表面標記物陽性的模型CTC。CLSM檢測及流式細胞術的結果顯示，明亮的NPs能特異性地與模型CTC細胞結合。由于熒光納米材料所具備的靶向性及明亮特性，這使得它們成為檢測 CTC細胞群或具有低標記物表達的細胞的理想材料。本研究的不足之處是并未在富含蛋白質的真實血液樣本中檢測制備的NPs是否仍具有CTC靶向能力，這將在后續(xù)研究中進一步探討。