魔芋精粉中葡甘聚糖含量的測(cè)定

李 浪，李茂纖，葉 坪，張澤俊，李俊杰，龔健康

(昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,云南 昭通 657000)

魔芋，其學(xué)名為蒟蒻(學(xué)名Amorphophallus konjac，簡(jiǎn)稱Konjac)，又名磨芋、花梗蓮、蛇六谷、鬼芋等，中國(guó)古代又稱妖芋，為天南星科植物[1]。我國(guó)魔芋資源屬于比較豐富的國(guó)家之一，有2000多年的栽培歷史，最早栽種是在我國(guó)的西南地區(qū)，我國(guó)目前栽種品種共有21種，它們主要是分布在福建、臺(tái)灣、陜西、四川、湖北、安徽、浙江、云南等地，主要種植有兩個(gè)品種白魔芋和花魔芋[2]。目前全球魔芋栽種主要集中分布在印度尼西亞、緬甸、中國(guó)、越南、日本等國(guó)。魔芋多生長(zhǎng)于疏林下、林緣以及溪谷兩旁濕潤(rùn)地，多生長(zhǎng)于海拔310m至2200m 的地區(qū)。根據(jù)中國(guó)魔芋區(qū)劃分區(qū)[3]，云南魔芋最適宜種植區(qū)是昭通市，它擁有全國(guó)優(yōu)質(zhì)金江白魔芋(葡甘聚糖含量高達(dá)74.04%遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)家一級(jí)>68%的標(biāo)準(zhǔn))原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)[4-6]，金沙白魔芋是全國(guó)魔芋最優(yōu)良的品種具有很大的研究?jī)r(jià)值。目前由昭通生產(chǎn)的魔芋精粉銷往國(guó)內(nèi)、日本和越南等地。

魔芋是一種傳統(tǒng)食品，具有低熱量、低脂肪和高纖維的優(yōu)良食品。魔芋中的膳食纖維對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)平衡調(diào)節(jié)有重要作用。在醫(yī)藥典籍《本草綱目》、《開(kāi)寶本草》等書中記載魔芋具有抗癌、利尿、解毒消腫、健胃、養(yǎng)發(fā)等功效[7]，其性味辛寒。除此之外，因?yàn)槟в缶邆淞己玫牧髯冃?、凝膠性、水溶性、增稠性、高黏性等，目前已經(jīng)逐漸應(yīng)用在食品保鮮、日用化工、工廠工業(yè)、醫(yī)藥、等領(lǐng)域，魔芋現(xiàn)在已經(jīng)成為一種優(yōu)質(zhì)的膳食纖維源和功能性原料。魔芋塊莖中含有的營(yíng)養(yǎng)成分主要有葡甘露聚糖、淀粉、纖維、蛋白質(zhì)，其中主要葡甘露聚糖是效成分，由D-葡萄糖和D-甘露糖通過(guò)β-1，4糖苷鍵合的高分子多糖。葡甘露聚糖由于具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，不提供熱能的特點(diǎn)，所以其具有調(diào)節(jié)膽固醇代謝的功能、減肥、便秘、糖尿病、對(duì)動(dòng)脈硬化、膽結(jié)石、肥胖癥等有顯著療效，被稱健康食品。測(cè)定魔芋中葡甘聚糖的含量有重要的意義[8]，葡甘露聚糖含量的測(cè)定方法主要有3,5-二硝基水楊酸比色法、氣相色譜法費(fèi)林滴定法、苯酚比色法等[9]，其中費(fèi)林滴定法是經(jīng)典的國(guó)標(biāo)法，但操作太繁雜；苯酚比色法測(cè)定中試劑不穩(wěn)定，并且苯酚毒性較大；氣相色譜法測(cè)定需要使用氣相色譜儀，導(dǎo)致使用受到限制。而3，5-二硝基水楊酸比色法操作較簡(jiǎn)便，測(cè)定成本低，所以此測(cè)定方法是魔芋葡甘露聚糖測(cè)定中理想的方法。本論文采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定本土魔芋精粉中葡苷聚糖的含量，為魔芋精粉的品質(zhì)控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

儀器：800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)，磁力攪拌器(國(guó)華88-1)，恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)，電子天平(上海良平)，7200可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海菁華)，比色皿，250mL容量瓶，25mL容量瓶，10mL容量瓶，試管，玻璃棒，燒杯，移液管。

藥品：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)的氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉，3，5-二硝基水楊酸(廣東光華科技股份有限公司)，昭通魔芋精粉，甲酸，鹽酸，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品。3，5-二硝基水楊酸(DNS)配制： 用電子天平準(zhǔn)確稱取3，5-二硝基水楊酸1.0057g，加入20mL 2.0mol/L-1NaOH，在稱取酒石酸鉀鈉30.0989g充分?jǐn)嚢枞芙?，用蒸餾水定容至100mL。放置兩天，用漏斗過(guò)濾，保存在棕色試劑瓶中備用。甲酸-氫氧化鈉緩沖液配制：移取1mL甲酸放入燒杯中加入60mL蒸餾水，用電子天平準(zhǔn)確稱取0.25g氫氧化鈉加入燒杯，攪拌溶解倒入250mL容量瓶中加蒸餾水定容至刻度線。1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用電子天平稱取分析葡萄糖0.1004g放入燒杯加蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，倒入容量瓶，定容?00mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用分光光度計(jì)在480～550nm之間掃描，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在490nm處有最大吸收波長(zhǎng)，所以確定其最大波長(zhǎng)為490nm。

1.2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用移液管分別準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4,0.6,0.8,1.0,1.2mL分別置于10mL的容量瓶中，加蒸餾水補(bǔ)足3mL。取3mL蒸餾水做空白對(duì)照組，在6個(gè)容量瓶中分別準(zhǔn)確加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑并搖勻。置于提前加熱好的恒溫水浴鍋中，加熱5min。取出至于試管架上冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10mL搖勻。

在490nm處測(cè)定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為：y=7.31x+0.0666 ，R2=0.9995，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 魔芋葡甘聚糖提取液制備、提取和測(cè)定

準(zhǔn)確稱取3份昭通魔芋精粉約0.2g，放入100mL燒杯中并加入50mL甲酸-氫氧化鈉緩沖溶液。在磁力攪拌器上勻速攪拌2小時(shí)以上，并靜置溶脹過(guò)夜。倒入100mL容量瓶并用配制好的甲酸-氫氧化鈉緩沖溶液定容至刻度線，搖勻。在離心機(jī)上以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘使其溶液分層。上清液就為魔芋精粉中葡苷聚糖提取液。

用移液管準(zhǔn)確移取上述魔芋葡甘聚糖提取液5.00mL，加入到25mL容量瓶中。在準(zhǔn)確移取3 mol/L的硫酸2.50mL加入，搖勻。放置于恒溫水浴鍋中加熱水解1.5h。用冷卻水冷卻到室溫。加入2.5mL 6mol/L的氫氧化鈉溶液搖勻后再加入蒸餾水定容至刻度線。

分別移取上述制得的魔芋精粉葡苷聚糖水解液和蒸餾水(作為空白對(duì)照)2.5mL放置于試管中，加入3，5-二硝基水楊酸顯色劑(DNS)，在恒溫水浴鍋中水浴5min。自然冷卻后倒入到25mL容量瓶中加蒸餾水定容至刻度線，測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果分析

2.1 魔芋葡甘聚糖提取條件的優(yōu)化

2.1.1 水解時(shí)間對(duì)魔芋葡甘聚糖吸光度的影響

取上述待測(cè)液2.5mL，分別水解0.5，1，1.5，2，2.5h 5個(gè)梯度下，按上述2.2.2實(shí)驗(yàn)方法在最大波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其最佳水解時(shí)間在1.5h。

表1 水解時(shí)間對(duì)魔芋葡甘聚糖提取效果的影響

2.1.2 鹽酸加入量對(duì)魔芋葡甘聚糖吸光度的影響

取上述待測(cè)液2.5mL，選取1，1.5，2，2.5，3mL 5個(gè)梯度鹽酸加入量，按上述2.2.2方法測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鹽酸最佳加入量為1mL。

表2 鹽酸加入量對(duì)魔芋葡甘聚糖提取效果的影響

2.1.3 氫氧化鈉加入量對(duì)魔芋葡甘聚糖吸光度的影響

分別選取0.5，0.75，1，1.25，1.5mL 5個(gè)梯度作為氫氧化鈉加入量。按上述2.2.2方法測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氫氧化鈉最佳加入量為0.5mL。

表3 氫氧化鈉加入量對(duì)魔芋葡甘聚糖提取效果的影響

2.1.4 共沸時(shí)間對(duì)魔芋葡甘聚糖吸光度的影響

分別共沸3,5,7,9min和11min 5個(gè)梯度下，按上述2.2.2方法測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其共沸最佳時(shí)間為5min。

表4 共沸時(shí)間對(duì)魔芋葡甘聚糖提取效果的影響

2.2 穩(wěn)定性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

移取上述2.2.2制備的溶液，每隔30min測(cè)其吸光度，連續(xù)測(cè)定5h考察其穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5h內(nèi)顯色穩(wěn)定，吸光度無(wú)明顯變化。

分別稱取5份0.2 g的魔芋精粉，按其2.2.2步驟做三組重復(fù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RSD為0.0377%，小于5%，該方法重現(xiàn)性較好,該方法可行。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

移取2.5mL水解溶液，用按其2.2.2步驟進(jìn)行含量測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值為0.0023%，說(shuō)明精密度良好。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取2.5mL水解試液2份，一份按其2.2.2步驟進(jìn)行含量測(cè)定，一份加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0.1mL(相當(dāng)于0.1mg)，按相同的方法進(jìn)行溶液的制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率得95.52% 。

2.6 魔芋精粉中葡甘聚糖含量

步驟2.2.2中測(cè)定的吸光度值如表5所示，根據(jù)線性回歸方程式計(jì)算出魔芋中葡甘聚糖的濃度。再根據(jù)下式葡甘聚糖的含量的計(jì)算公式算出魔芋中葡甘聚糖的含量，其中ε為0.9，是葡甘聚糖中葡萄糖和甘露糖殘基分子量與其水解后生成的葡萄糖和甘露糖分子量之比[10]，為多糖的校正系數(shù)，T樣為葡甘聚糖水解液分光光度法測(cè)定查標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線濃度；m為樣品的重量。通過(guò)計(jì)算得知魔芋葡甘聚糖含量為83%。

表5 魔芋葡甘聚糖含量的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本論文采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定魔芋精粉中葡苷聚糖的含量，得知含量在83%。在測(cè)定中，魔芋中除魔芋葡苷聚糖外還存在半纖維素、少量游離還原糖及淀粉纖維素等。在劇烈攪拌下魔芋葡甘聚糖可形成穩(wěn)定的膠體溶液。天然半纖維素和淀粉纖維素由于不溶于水，因此可以通過(guò)沉淀離心將半纖維素和淀粉纖維素分離出去，從而達(dá)到提高測(cè)定的準(zhǔn)確性。由于魔芋的膨脹系數(shù)很大，導(dǎo)致魔芋精粉中葡甘聚糖顆粒容易吸水而溶脹，使提取多糖的時(shí)候試劑用量變大，所以取樣的時(shí)候要盡量少取一點(diǎn),一般在1g左右。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用100mL的緩沖溶液定容后需要放置過(guò)夜，離心取上清液液再進(jìn)行酸水解從而提高效率。本實(shí)驗(yàn)采用以鹽酸水解方法提取魔芋中葡甘露聚糖,方法簡(jiǎn)單， 耗費(fèi)試劑量少，產(chǎn)率高，工藝比較簡(jiǎn)單