青蒿素的合成與應(yīng)用研究綜述

于德鑫,劉乃仲,何 帥,石 敏,張艷芬

(菏澤學(xué)院,山東 菏澤 274015)

1 青蒿素的發(fā)現(xiàn)

青蒿素是我國藥學(xué)家屠呦呦受東晉葛洪《肘后備急方》“青蒿絞汁服”的啟發(fā)，首創(chuàng)低沸點溶劑提取法從傳統(tǒng)中藥青蒿中提取并自主研發(fā)的一種抗瘧疾特效藥。1975年，通過多位科學(xué)家化學(xué)結(jié)構(gòu)分析、光譜解析等方法確定了青蒿素的分子式為C15H22O5，是一種含有過氧基團的倍半萜內(nèi)酯1。這些研究結(jié)果收錄于《青蒿素的化學(xué)研究》，并在1980年“青蒿素”國際會議上，得到了國內(nèi)外專家的高度認可，為基于青蒿素的藥物治療研究奠定了基礎(chǔ)。

2 青蒿素的制備方法

2.1 化學(xué)合成

早在1983年國外的化學(xué)家Hofheinz W等2通過化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了青蒿素的化學(xué)合成方法，以(-)-2-異薄勒醇為原料，利用光氧化反應(yīng)引進氧基得到中間體，再經(jīng)過環(huán)合反應(yīng)合成了最終產(chǎn)物。合成倍半萜內(nèi)酯，主要有兩個限速步驟：倍半萜母核的折疊和環(huán)化；含過氧橋的倍半萜內(nèi)酯的形成程。1986年，我國科學(xué)家周維善以R-(+)-香茅醛為原料合成了青蒿素(合成過程如圖1所示)。但由于合成步驟繁瑣，總收率較低，甚至不到1%，尚未實現(xiàn)工業(yè)化的可行性測評3。

2.2 生物合成

青蒿素存在于中草藥青蒿的花葉中，莖中不含有，是一種含量非常低的萜類化合物，生物合成途徑非常復(fù)雜。目前可通過三種方式進行青蒿素的生物合成，一是通過對控制青蒿素合成的關(guān)鍵酶進行調(diào)控，添加生物合成的前體來增加青蒿素的含量；二是激活關(guān)鍵酶控制的基因，大幅度增加青蒿素的含量；三是利用基因工程手段改變關(guān)鍵基因，以增強它們所控制酶的作用效率4。但生物合成過程中，青蒿素的含量受光照、外源激素、芽分化等生理生態(tài)因子的影響很大，溫度對于生物合成也有極大影響，通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，青蒿幼苗在40℃條件下，處理36 h后，青蒿素的質(zhì)量分數(shù)提高到最大為68%5。除青蒿之外，其它植物也可以合成青蒿素， 2011 年研究人員從煙草中合成青蒿素6。此方法與傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，所用的化學(xué)試劑大大減少，有利于環(huán)境的保護，且該生物合成方法的受體為煙草，在我國較為廣泛，因此原料來源較為豐富，但不足的是用煙草合成青蒿素過程中的某些反應(yīng)基質(zhì)并不清楚，還有待開發(fā)，但該合成方法仍有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

2.3 提取純化

分離純化工藝主要有溶劑外加能量協(xié)助提取法、提取重結(jié)晶法、超臨界CO2萃取法和溶劑提取層析法 7。溶劑提取重結(jié)晶法一般采用的溶劑汽油法，乙醇法和堿水提取酸沉淀法進行生產(chǎn)，此類方法明顯增加了青蒿素植物的有效利用率。堿水提取酸沉淀法：取一定量的青蒿枝葉干粉加入乙醇攪拌浸提，得到乙醇提取液，減壓干燥，將其溶于乙醚-水兩相溶液中，分別得到青蒿素和青蒿酸。此種方法的青蒿酸收率達到90%，青蒿素的提取率為57%。乙醇法8：取一定量的青蒿枝葉干粉，用稀乙醇浸泡24 h，得到乙醇提取液，將其注入連續(xù)萃取裝置，再用含苯和乙酸乙酯的溶劑汽油萃取，得到醇相和萃取相，醇相可循環(huán)使用，萃取相用活性炭脫色，過濾，回收溶劑，然后得到濃溶液，再冷卻結(jié)晶得到青蒿素粗晶物，再用乙醇重結(jié)晶得到青蒿素成品。此方法有收率較高，成本較低，步驟較少，操作簡單，安全等優(yōu)點。溶劑汽油法：取一定量的青蒿枝葉干粉，用8-10倍120號溶劑汽油浸泡3次，得到溶劑汽油提取液，再減壓濃縮并放置結(jié)晶，得青蒿素粗品，用少量120號溶劑汽油多次洗滌，50%乙醇醇結(jié)晶2-3次，最終得到青蒿素白色針晶。此種方法工藝步驟簡便，容易大批量生產(chǎn)使用。溶劑提取層析法有三種提取方法，分別是丙酮-硅膠柱層析法、低沸汽油-超短粗型球狀擴孔硅膠層析法、乙烷提取-乙烷/乙腈-硅膠柱層析法，都已經(jīng)申請了專利。 趙兵9等對超聲波用于強化石油醚提取青蒿素做過實驗研究，超聲波強度、處理時間、處理間歇次數(shù)、攪拌時間等都對提取率有一定影響。在20 kHz、90 W超聲波、50℃、單次作用時間20 min后再攪拌10 min的條件下，提取率最高為83%。韓偉10等人通過化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)利用微博輔助提取法(MAE)，選用6#抽提溶劑油(一種無色透明液體，不含四乙基鉛，硫和芳烴含量較低的有機溶劑)，以120目黃花高粉末為原料，通過高效液相色譜法(HPLC)分析，發(fā)現(xiàn)青蒿素的提取率可達到84.01%。

圖1 青蒿素的合成路線

3 青蒿素的應(yīng)用

提到青蒿素，人們首先會想到它的抗瘧疾功用，WHO認為，青蒿素是治療瘧疾耐藥性效果最好的藥物，以青蒿素類藥物為主的聯(lián)合療法，也是當(dāng)下治療瘧疾的最有效最重要手段。但是近年來隨著研究的深入，青蒿素其它作用也越來越多被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用研究，如抗腫瘤、治療肺動脈高壓、抗糖尿病、胚胎毒性、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)等。

3.1 抗瘧疾

瘧疾(俗稱：打擺子寒熱病)屬于蟲媒傳染病，是受瘧原蟲感染的按蟲叮咬人體后而引起的一種傳染病，長時間多次發(fā)作后出現(xiàn)可肝脾腫大，且伴隨貧血等癥狀。瘧疾能夠得到一定程度的治療，青蒿素功不可沒。青蒿素結(jié)構(gòu)中過氧鍵具有氧化性，是抗瘧的必需基團。作用機理是青蒿素在體內(nèi)產(chǎn)生的自由基團與虐原蛋白結(jié)合，改變瘧原蟲的細胞膜結(jié)構(gòu)。自由基團與瘧原蛋白結(jié)合之后會使線粒體的雙層膜脹裂，最終脫落，導(dǎo)致瘧原蟲的細胞結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，同時細胞核內(nèi)的染色質(zhì)也會受到一定的影響。另一方面，氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，青蒿素作用后。瘧原蟲對異亮氨酸的吸收減少，導(dǎo)致蟲體蛋白的合成受阻11。黃花蒿不僅可以殺滅病原蟲，還具有抗血吸蟲作用、治療弓形蟲感染作用、抗卡氏肺孢子蟲作用、抗球蟲作用12等。經(jīng)臨床試驗證明，青蒿素及其衍生物在治療瘧疾的過程中，并未發(fā)現(xiàn)特別明顯的副作用13。

3.2 抗腫瘤

惡性腫瘤是危害人類健康的第一大殺手，若不及時醫(yī)治則會危害生命安全。體外實驗表明，一定劑量的青蒿素可以使肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞等多種癌細胞的凋亡，明顯抑制癌細胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以調(diào)控腫瘤細胞的周期蛋白表達，增強CKIs作用，導(dǎo)致腫瘤細胞周期阻滯；或者導(dǎo)致細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成等來抵抗腫瘤的發(fā)生和發(fā)展14。青蒿素對白血病的治療，是通過作用在白血病細胞的細胞膜，增加膜的通透性，改變滲透壓，導(dǎo)致細胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，從而能激活鈣蛋白酶，使其細胞膜脹裂，同時加速促使細胞凋亡物質(zhì)的釋放，增加細胞凋亡速度15-17。

3.3 治療肺動脈高壓

隨著科研人員的不斷探索，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)青蒿素對于肺動脈高壓也有一定的治療作用。肺動脈高壓(PAH)是肺動脈重構(gòu)為特征和以肺動脈壓力升高到一定界限的病理生理狀態(tài)，可以是并發(fā)癥或綜合征。青蒿素用于治療肺動脈高壓：通過舒張血管降低PAH患者的肺動脈壓力，改善癥狀；Zaiman18等發(fā)現(xiàn)青蒿素具有抗炎作用，青蒿素及其內(nèi)核物質(zhì)對多種致炎因子有抑制作用，且還可以抑制炎性介質(zhì)產(chǎn)生一氧化氮；青蒿素具有免疫調(diào)節(jié)作用；馮義柏19等通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素能夠抑制血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞的增殖，進而在PAH的治療過程中發(fā)揮著重要作用；青蒿素能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，從而抑制肺血管重構(gòu)；青蒿素可以抑制PAH相關(guān)細胞因子的表達，進一步增強青蒿素抗血管重構(gòu)作用；曹治東20等研究發(fā)現(xiàn)青蒿素可抑制瘢痕成纖維細胞增生和膠原量增多，進而抑

制基質(zhì)ECM過度沉積的現(xiàn)象，因此青蒿素有助于肺動脈的重構(gòu)逆轉(zhuǎn)；青蒿素的促凋亡作用，青蒿素可以促進VSMC凋亡進而逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)。

4 小結(jié)

綜上所述，青蒿素的發(fā)展來源已久，在抗瘧疾、抗腫瘤、抗心律失常、治療肺動脈高壓、免疫調(diào)節(jié)等方面的研究發(fā)展迅速，療效顯著。但是因其植物含量較低提取困難，化學(xué)合成步驟繁瑣，導(dǎo)致最終收率較低，成本較高。因此，尋找適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)合成方法，如使用適當(dāng)?shù)闹虚g體、反應(yīng)條件、減少一些不必要的步驟等，提高合成收率，對青蒿素的進一步研究應(yīng)用具有重要意義。