施氏假單胞菌胞內(nèi)NapA/NapB蛋白的多克隆抗體制備及蛋白免疫印跡分析

周 萌，柴曉利

(同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092)

聚羥基脂肪酸酯(PHAs)是存在于細(xì)胞質(zhì)中被膜包圍的直徑0.2～0.5 μm的微粒，由于其低水溶性和高分子質(zhì)量，也是理想的碳能量貯存物質(zhì)。PHAs的合成需要還原性輔酶I，其來源有兩種觀點：一是由乙酰輔酶通過三梭酸循環(huán)產(chǎn)生[1]，一是細(xì)胞內(nèi)糖原降解產(chǎn)生[2]。其中，第二種觀點被廣泛接受。PHAs的貯存通常發(fā)生在電子供體與受體的來源不穩(wěn)定的條件下，有碳源儲備的細(xì)菌相比沒有碳源儲備的細(xì)菌而言，更具競爭優(yōu)勢。最常見的PHAs是聚羥基丁酸酯(PHB)，在能以PHB為碳源的細(xì)菌胞內(nèi)存在PHB水解酶，在這類酶的作用下細(xì)菌完成對PHB的降解。許多能利用PHB的細(xì)菌也能以硝酸鹽作為電子受體，如Comamonadaceae[3],Brevundimonas[4]和Acidovorax[5]等。當(dāng)營養(yǎng)條件受到限制時，這些細(xì)菌就會從以氧氣為電子受體轉(zhuǎn)變?yōu)橐韵跛猁}為電子受體。

在反硝化脫氮過程中，硝態(tài)氮是電子受體，外加有機(jī)碳源是間接電子供體，直接電子供體是有機(jī)碳源在細(xì)菌體內(nèi)合成的PHAs。對于內(nèi)源反硝化，在碳氮比相對較高的環(huán)境下PHAs才會積累，因此已有的研究主要關(guān)注如何通過改變工藝條件提高PHAs的合成量[6-7]。大部分的反硝化細(xì)菌都是兼性厭氧菌，在氧氣作為更高效的電子受體存在時，通過直接競爭或是酶的作用抑制反硝化過程。Schulthess和Gujer[8]首次報道了低C/N比進(jìn)水條件下，反硝化過程中不同價態(tài)氮素(硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氧化亞氮)的共存對還原效率具有抑制作用，這是由于異養(yǎng)反硝化細(xì)菌可以利用多種胞外碳源作為電子供體，相互之間產(chǎn)生競爭。Pan[9]等人也報道了在反硝化系統(tǒng)中甲醇作唯一碳源，當(dāng)外界碳源過量時發(fā)生了類似的“電子競爭”效應(yīng)。

在先前的研究中，為探究碳源對微生物生長代謝的影響機(jī)理，筆者利用組學(xué)手段宏觀分析了細(xì)菌體內(nèi)蛋白的變化水平，發(fā)現(xiàn)在不同碳源培養(yǎng)條件下，典型反硝化細(xì)菌施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)胞內(nèi)NapA及NapB的蛋白表達(dá)量有明顯變化，且這兩種蛋白質(zhì)與硝酸鹽還原過程息息相關(guān)[10-11]。宏蛋白組學(xué)可以覆蓋到多個代謝途徑的蛋白，但對儀器有特殊需求且檢測成本較高。為更深入地探究碳源和細(xì)菌生長代謝的內(nèi)在聯(lián)系，需要進(jìn)一步驗證PHAs對兩種蛋白的調(diào)控作用，擬通過免疫學(xué)手段直接檢測細(xì)菌體內(nèi)NapA和NapB的含量。蛋白免疫印跡法是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗原抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測的方法。經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體如PVDF膜上，能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，和特異性抗體結(jié)合，再與標(biāo)記過的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以達(dá)到檢測的目的[12]。蛋白免疫印跡已被廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)，本研究針對已知的蛋白NapA和NapB，選取多肽片段合成抗原，作用于免疫對象使其產(chǎn)生特異性抗體，并將抗體用于施氏假單胞菌胞內(nèi)目標(biāo)蛋白檢測，旨在建立較為成熟的免疫印跡方法，為進(jìn)一步研究碳源對微生物生長代謝的影響機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種及其培養(yǎng)條件

實驗用菌種(CICC 10428)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，活化后接種至LB培養(yǎng)基中，于30℃ 160r/min條件下培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

對照組培養(yǎng)基A：CH3COONa 10g,KNO32.0g,MgSO4·7H2O 0.2g,KH2PO40.5g,微量元素溶液 2mL,用蒸餾水定容至1L pH值 7.2。實驗組培養(yǎng)基B：其他條件不變，將對照組中的10g CH3COONa換成10g PHA。其中微量元素溶液：EDTA 50.0g,ZnSO42.2g,CaCl25.5g,MnCl2·4H2O 5.06g,FeSO4·7H2O 5.0g,CuSO4·5H2O 1.57g,CoCl2·6H2O 1.61g,溶解后用蒸餾水定容至1 L pH值 7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 單一碳對照試驗

將配置好的培養(yǎng)基A/B分裝至250mL錐形瓶中，每個錐形瓶100mL培養(yǎng)液，編號A1/A2/B1/B2，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液各1mL接種至四個錐形瓶中，于30℃、160 r/min 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。48h后取菌液在4℃ 12000 g條件下離心10min，去除上清液后用PBS清洗三次，每一步完成后經(jīng)4℃ 12000 g離心5min。將樣品放入-80℃冰箱備用。

1.2.2 免疫原的制備與免疫過程

根據(jù)蛋白序列選擇如下幾個肽段進(jìn)行合成(表1)：

表1 NapA和NapB的抗原合成肽段序列Tab.e 1 Synthetic peptides of NapA and NapB antigen

采用Fmoc固相合成法[13]從多肽的羧基端向氨基端合成得到多肽樹脂，用TFA法將多肽從樹脂上切割下來，粗提后得到粗品，再經(jīng)高效液相色譜儀C18反相色譜分離柱分離純化后冷凍抽干。取純化后的多肽10mg與血藍(lán)蛋白15mg在縮合劑的催化下進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到多肽-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物，即為免疫原。

取四只健康、大小相近的新西蘭大白兔Luran、Viran、Blubb和Resan，進(jìn)行病原菌檢疫后，經(jīng)過一周的觀察，兔子皮毛光澤且飲食正常，可進(jìn)行免疫。免疫原與等量的弗氏完全佐劑(FCA)或弗氏不完全佐劑(FIA)充分乳化后，分別在兔子背部皮內(nèi)多點注射。免疫程序見表2。最后一次免疫后得到的抗血清，經(jīng)ProteinA親和層析柱純化，得到純化后抗體lg G。

表2 免疫程序Tab.e 2 Immune schedule

1.2.3 ELISA效價測定

將抗原稀釋在包被緩沖液0.1M NaHCO3溶液中，使多肽片段的包被濃度為4 μg/mL。用抗原包被液包被酶聯(lián)反應(yīng)板，每孔100 μL，并用塑料薄膜蓋住酶聯(lián)反應(yīng)板以防溶液揮發(fā)，37℃包被2h。包被完成后用ELISA wash buffer(1% NaCl,0.05% Tween 20)清洗反應(yīng)板3次，每次停留5min，濾紙上拍干備用。在包被好的酶聯(lián)板中每孔先加入100uL PBST，取第3次免疫后兩周的兔抗血清，按1∶11稀釋。向第一個孔中加入10 μL稀釋后的血清，用槍頭輕輕吸取若干次使其混勻。再從第一個孔中吸取10 μL液體到下一個孔中，重復(fù)以上操作。最后一孔用免疫前的兔血清做陰性對照，37℃孵育1h并在搖床上振蕩10min，用ELISA wash buffer洗滌3次，每次停留5min，拍干。用PBST按1∶20000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(Agrisera,AS09 602)，振蕩器上孵育30min，再用ELISA wash buffer洗滌。顯色劑為TMB顯色液(AS15 TMB-HRP)，每孔加入100 μL，然后加入終止反應(yīng)液，30min內(nèi)在450nm處讀數(shù)。

1.2.4 蛋白免疫印跡鑒定

取出-80℃保存的樣品，每組加100μL RIPA裂解液，裂解液中已經(jīng)加入1mM PMSF，以及廣譜蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑。超聲3次，每次5 s，冰上裂解2 h。4℃ 12000 g高速離心10 min，吸取上清液用于蛋白定量。每孔200μL BCA液與4μL硫酸銅溶液，配制成BCA 蛋白定量工作液使用。37°C恒溫下孵育30 min，讀取酶標(biāo)儀讀數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度，并最終將濃度調(diào)整為2μg/μL。

根據(jù)目的蛋白的分子量，配制10%和15%的分離膠，濃縮膠為5%。樣品中加入5X loading buffer，充分混勻后，沸水浴10min，使蛋白質(zhì)變性。電泳條件：濃縮膠恒壓90V約20min；分離膠恒壓160V，通過預(yù)染蛋白Marker來確定電泳停止時間。電泳時兩塊凝膠同時進(jìn)行，其中一塊凝膠用來考馬斯亮藍(lán)染色，確保蛋白質(zhì)分離。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜：300mA恒流，0.45μm孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間60min。轉(zhuǎn)膜完成后，用麗春紅染色試劑對膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。然后將膜浸沒在5% BSA-TBST中室溫下輕搖60min。棄去封閉液，用TBST清洗5次，每次3min。用5% BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育15min，放4℃過夜。倒掉一抗稀釋液，TBST洗5次，每次3min。用5% NFDM-TBST稀釋二抗，加入識別對應(yīng)一抗的HRP標(biāo)記二抗，

1∶5000稀釋，室溫輕搖40mins。ECL加到膜上后反應(yīng)3～5min，膠片曝光10s到5min(曝光時間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整)，顯影2min，定影。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體效價檢測結(jié)果

圖1 抗NapA的血清效價

Fig.1 Serum titer of anti-NapA antibody

圖2 抗NapB的血清效價Fig.2 Serum titer of anti-NapB antibody

用合成的多肽作為包被源，包被濃度4 μg/mL，四只小鼠第三次免疫后兩周的血清按照1∶121，1∶1331，1∶14641，1∶161051的比例稀釋。根據(jù)ELISA結(jié)果對其效價進(jìn)行分析，對NapA，Luran和Virkat產(chǎn)生的血清多抗效價為1∶14000(圖1)，而對NapB，Blubb產(chǎn)生的血清多抗效價為1∶160000，Resan產(chǎn)生的血清多抗效價更高大于1∶160000(圖2)。

2.2 蛋白免疫印跡結(jié)果

圖3 菌體內(nèi)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.3 SDS-PAGE of proteins extracted from strains

圖4 菌體內(nèi)蛋白的Western Blotting分析Fig.4 Western Blotting of proteins extracted from strains

SDA-PAGE結(jié)果如圖3所示，各組樣品都有明顯分離，且在低蛋白分子量區(qū)域更為明顯。對菌體內(nèi)提取的總蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，與合成的NapA及NapB抗體進(jìn)行反應(yīng)，實驗結(jié)果表明在四組樣品中在30-40KDa附近的條帶清晰可見且較為整齊，在100KDa和15KDa附近也出現(xiàn)了明顯的反應(yīng)帶(圖4)。

3 討論

本研究選取三個片段進(jìn)行多肽合成，制備了免疫原，并通過免疫兔子獲得了NapA和NapB蛋白的多克隆抗體。免疫效果的好壞對抗體制備及后續(xù)免疫印跡分析可靠性有直接影響，故需要一系列的驗證試驗。ELISA檢測結(jié)果表明，制備的NapA和NapB免疫抗原均能夠針對實驗兔子產(chǎn)生良好的免疫效果。NapB免疫原效果甚佳，血清效價大于1∶160000，NapA免疫原的效價也可以達(dá)到1∶14000。

與單克隆抗體不同，多克隆抗體無法進(jìn)行敏感性分析，效價相對較低的抗體在免疫印跡分析中可能也會對目標(biāo)蛋白產(chǎn)生敏感可靠的反應(yīng)[14]。選取Virkat和Blubb產(chǎn)生的抗血清進(jìn)行后續(xù)Western Blot實驗，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，目標(biāo)蛋白NapA和NapB的理論蛋白質(zhì)分子量分別約為93KDa和16KDa，所選的內(nèi)參蛋白GADPH為糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，檢測條帶一般為36KDa[15]。本研究中的內(nèi)參條帶清晰且整齊，在目標(biāo)條帶區(qū)域也可以看到明顯反應(yīng)帶，說明制備出的抗體可針對NapA或NapB進(jìn)行免疫印跡分析。

一般而言內(nèi)參蛋白在同種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)量一般恒定且不受誘導(dǎo)物質(zhì)影響，若對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，可通過內(nèi)參蛋白實現(xiàn)半定量。后續(xù)試驗中將改變施氏假單胞菌培養(yǎng)過程中的碳源條件，進(jìn)一步測定NapA及NapB的含量變化，探究其內(nèi)在聯(lián)系。

4 結(jié)論

本研究中制備的多克隆抗體具有良好的免疫性能，可用于檢測施氏假單胞菌胞內(nèi)的NapA及NapB蛋白，特異性強(qiáng)且成本相對較低。選取GADPH作為內(nèi)參蛋白，后續(xù)研究改變實驗條件，還可通過灰度分析進(jìn)行半定量。