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      甲狀腺乳頭狀癌組織miR-129 表達與臨床病理特征的相關性

      2019-11-19 06:28:26
      浙江中西醫(yī)結合雜志 2019年11期
      關鍵詞:甲狀腺癌分級淋巴結

      李 瀅 劉 芳 馮 利 陳 雙

      甲狀腺癌是內分泌系統(tǒng)最常見的頭頸部腫瘤。甲狀腺癌的病理類型包括乳頭狀癌、未分化癌、髓樣癌及濾泡狀癌,其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常見的惡性腫瘤,占甲狀腺癌的70%左右[1]。盡管多數(shù)患者預后良好,但是仍有一部分PTC 出現(xiàn)高侵襲、早期轉移[2]。因此,開展PTC 相關分子標志物的研究,為臨床早期診斷和治療預后提供新的方法一直是臨床上的研究熱點。目前普遍認為,由正常細胞轉變?yōu)榘┘毎奂爸車M織器官或發(fā)生遠處轉移是一個及其復雜的基因變化[3]。微小RNA-129(miR-129)是一種內源性單鏈非編碼的小RNA 分子,有調控細胞的生長、分化、增生和凋亡的作用[4]。近年研究發(fā)現(xiàn),miR-129 在結直腸癌、前列腺癌等中呈低表達[5-6]。本研究旨在分析miR-129 在PTC 組織表達及其與臨床病理特征的相關性,現(xiàn)報道如下。

      1 資料與方法

      1.1 臨床資料 選取2010 年11 月—2014 年2 月浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心(集團)路橋醫(yī)院收治的PTC 患者125 例作為研究對象,其中男32 例、女93例,年齡20~75 歲,平均(40.36±8.42)歲。病理分級和臨床TNM 分期參照國際抗癌聯(lián)盟第6 版甲狀腺癌分期分級標準[7]:1 級77 例、2 級48 例;臨床TNM 分期:Ⅰ期24 例、Ⅱ期51 例、Ⅲ期35 例、Ⅳ期15 例。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核通過。患者均知曉本研究內容并簽署知情同意書。

      1.2 納入標準(1)均符合國際抗癌聯(lián)盟第6 版甲狀腺癌分期分級標準;(2)均進行全甲狀腺切除+患側中央區(qū)淋巴結清掃;(3)均經術后病理學確診。

      1.3 排除標準(1)有嚴重肝腎功能不全者;(2)合并其他惡性腫瘤者;(3)入院前經過放療或化療等治療者;(4)臨床及隨訪資料不完整者。

      1.4 標本采集 選取125 例PTC 并行手術治療患者,收集PTC 癌變組織125 份作為研究組,另在手術過程中收集125 份距離癌組織邊緣5cm 以上正常甲狀腺組織為對照組,兩組組織標本均進行miR-129水平的檢測。

      1.5 定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測甲狀腺乳頭狀癌組及癌旁組織miR-129mRNA 表達 采用TRIzol[賽墨飛世爾科技(中國)有限公司,批號ab49534]提取0.3g 甲狀腺癌組織及癌旁組織總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒(美國Life Technologies 公司,批號C120835)產生第一鏈互補(c)DNA。使用GAPDH 進行標準化(GAPDH 正向引物5'-CTCGCTTCGGC-AGCACA-3';反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')。PCR 引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司提供并合成,序列如下:miR-182 正向引物:5'-CTTGCTATACAAGGGCAAGCACGAA-3',反向引物:5'-CTTGAGTACGACCAAATCCCGTC-3。具體操作:將2μL RNA 與1μloligo(dT)和10μL 無RNase 的去離子水混合,在PCR 機中在70℃下孵育5min 并立即在冰上冷卻。通過加入4μL 5X 緩沖液,2μL 10mM 脫氧核糖核苷酸三磷酸,1μL RNA 抑制劑和1μL 逆轉錄酶誘導cDNA 合成,然后在PCR 機中于42℃溫育1h。通過在70℃溫育5min 終止反應。使用THUNDERBIRDS YBR qPCR Mix 試劑盒(日本Toyobo Co,Ltd,Tokyo,Japan公司,批號6514)進行定量測量。對于PCR,將12.5μL 2XqPCR Mix,2.0μL 每 種 引 物(2.5μM),2.0μL cDNA 和8.5μL 雙蒸水加入0.2mL PCR 管中。擴增條件包括40 個循環(huán),95℃,15min,95℃,15s,55℃,30s,72℃,25s。然后將反應保持在4℃。使用閾值循環(huán)(Ct)的值確定每個靶基因的mRNA 表達。在與GAPDH 比較后使用2-ΔΔCT 方法計算相對表達。

      1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組間比較采用t 檢驗,計數(shù)資料以率(%)表示,兩組間采用χ2檢驗,采用Kaplan-Meier 法估計不同臨床特征PTC 患者的生存情況,通過非條件單因素和多因素Cox 比例風險回歸模型分析影響PTC 患者預后的相關因素,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結果

      2.1 兩組組織標本miR-129mRNA 表達水平比較PTC 患者其PTC 癌變組織miR-129 mRNA 表達水平低于癌旁正常組織[(0.66±0.21)比(1.89±0.48),P<0.01]。

      2.2 不同臨床特征PTC 患者甲狀腺癌組織miR-129 表達比較 根據(jù)ROC 曲線取miR-129 mRNA=0.49 時,約登指數(shù)最大為0.38。因此,miR-129 mRNA=0.49 時作為診斷PTC 的截點,miR-129 低表達患者(≤0.49)33 例(26.40%),miR-129 高表達患者(>0.49)92 例(73.60%)。miR-129 的表達與PTC 患者其年齡、性別、腫瘤大小情況均無明顯關系(P>0.05),miR-129 的表達與PTC 患者臨床分期、淋巴結轉移及病理分級的表達有顯著關系(P<0.001、P<0.001、P=0.018),見表1。

      表1 不同臨床特征的PTC 患者其miR-129 表達情況比較[例(%)]

      2.3 PTC 患者預后生存情況 本研究125 例PTC患者中,自出院后至隨訪結束存活4~60 個月,5 年生存率50.40%(63/125)。其中miR-129 高表達和低表達患者5 年總生存率分別為72.73%(24/33)和42.39%(39/92),經統(tǒng)計學分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

      2.4 影響PTC 患者預后的單因素分析 經單因素分析得出:臨床分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴結轉移、病理分級2 級及miR-129 水平低表達時患者生存時間均顯著縮短(P<0.05),見表2。

      2.5 影響PTC 患者預后Cox 多因素分析 經多因素Cox 比例風險回歸模型分析得出:臨床分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴結轉移、病理分級2 級及miR-129 水平低表達均為影響PTC 患者預后的獨立危險因素(P<0.001),見表3。

      3 討論

      機體內的細胞因子和基因的表達與患者治療及預后情況密切相關[8],故尋找影響患者病情進展和預后的相關因素是改善PTC 患者預后的關鍵。miRNA是一類長度為20~24nt 的單鏈非編碼微小RNA,廣泛存在于動植物中。腫瘤細胞組織miRNA 基因的改變存在多樣化,主要以基因缺失、過表達及基因擴增為主[9]。研究表明,miRNA 在細胞或組織中可充當抑癌基因或者促癌基因的角色,直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。相關研究證實,miR-34、miR-1301、miR-19等在PTC 異常表達,對PTC 患者造成嚴重影響[11-12]。

      表2 影響PTC 患者預后的單因素分析

      本組研究中,PTC 癌變組織miR-129 表達低于癌旁正常組織,患者臨床分期越高、有淋巴結轉移、病理分級越高其miR-129 低表達率明顯升高,這提示miR-129 在機體中的表達與PTC 的發(fā)生和疾病進展有密切關系。于浩等[13]研究表明,miR-129 在膀胱癌組織呈低表達水平,且支持miR-129 可能成為膀胱癌診斷的無創(chuàng)腫瘤標記物,可用于早期診斷及預后判斷和復發(fā)的預測。潘印等[14]研究顯示,在前列腺癌患者,miR-129 在腫瘤低分化、病理分期越高中呈低表達。本研究結果與上述結果一致,進一步證實miR-129 參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。多因素Cox 回歸分析顯示,臨床分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴結轉移及病理分級2 級及miR-129 低表達均為PTC 患者預后獨立危險因素(P<0.05)。既往研究表明,張力蛋白同源的基因、人類第10 號染色體缺失的磷酸酶及程序性細胞死亡因子4、肌球蛋白1 等在惡性腫瘤形成過程中起重要作用的抑癌基因,均為miR-129 的下游靶基因,通過調控這些下游靶基因,進而調控這些因子所在的信號傳導通路,從而在惡性腫瘤的發(fā)生和進展中起促進作用[15]。由此可見,miR-129 在PTC 患者疾病的發(fā)生、進展以及預后中有著重要的影響,因此,miR-129 可作為判斷甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及預后的生物標志物,臨床上檢測miR-129 表達水平,預測PTC 患者的預后情況。

      表3 影響PTC 患者預后Cox 多因素分析

      綜上所述,在PTC 癌組織miR-129 以較低水平表達,隨患者臨床分期越高、有淋巴結轉移、病理分級越高時其表達率均上升。miR-129 表達水平與腫瘤的進展程度和惡性程度呈負相關,miR-129 低表達PTC患者預后相對較差,檢測miR-129 表達水平有利于PTC 的診斷及預后評價。但本組研究所選樣本量較少及研究及隨訪時間過短,對于miR-129 的表達是否受其他因素影響尚未明確,需進一步深入研究。

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