Chk1及其抑制劑調控腫瘤作用機制研究

于祥菊　宋碧瑩　劉瀅　呂冬霞

摘要：細胞周期檢查點激酶1（Chk1）是由抑癌基因Chk1編碼的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr激酶），廣泛存在于哺乳動物細胞內。近年來，多項國內外研究表明Chk1及其抑制劑能調控腫瘤的形成與發(fā)展?；诖?，本文以Chk1及其抑制劑的概況和應用為基礎，總結其多向調控腫瘤細胞的作用機制，旨在為Chk1及其抑制劑的臨床應用和開發(fā)、相關藥物的研發(fā)提供參考。

關鍵詞：Chk1;抑制劑;腫瘤細胞;抑癌基因

中圖分類號：R730.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.013

文章編號：1006-1959（2019）19-0039-05

Study on the Mechanism of Chk1 and Its Inhibitors Regulating Tumor

YU Xiang-ju，SONG Bi-ying，LIU Ying，LYU Dong-xia

（Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

Abstract：Cell cycle checkpoint kinase 1 （Chk1） is a serine/threonine （Ser/Thr kinase） encoded by the tumor suppressor gene Chk1 and is widely found in mammalian cells. In recent years， a number of domestic and foreign studies have shown that Chk1 and its inhibitors can regulate the formation and development of tumors. Based on this， based on the profile and application of Chk1 and its inhibitors， this paper summarizes the mechanism of multi-directional regulation of tumor cells， aiming to provide reference for the clinical application and development of Chk1 and its inhibitors， and the development of related drugs.

Key words：Chk1;Inhibitor;Tumor cells;Tumor suppressor gene

腫瘤是由遺傳物質改變導致細胞過度增殖而形成的贅生物。傳統(tǒng)的治療方法多首選外科治療，加以輔助放射治療或化學藥物治療?，F(xiàn)今，腫瘤治療已逐漸進入分子領域。靶向腫瘤增殖、擴散位點的抑制劑也已廣泛應用，明顯提高了患者的生存周期和質量。已有研究證實，DNA損傷應答信號網絡（DNA damage response，DDR）是腫瘤形成過程中的主要調節(jié)機制[1]。而在DDR中，Chk1是除p53外誘導DNA損傷最常見的核心蛋白[2]。到目前為止，關于Chk1及其抑制劑調控腫瘤的作用機制的研究引起廣泛關注。本文主要總結Chk1抑制劑調控腫瘤的作用機制，以期擴展Chk1的相關藥物研發(fā)。

1 Chk1概述

Chk1蛋白屬于Ser/Thr激酶家族，分子量約為54 kD。由人11號常染色體長臂2區(qū)4帶2亞帶上的基因編碼。cDNA全長約1891 bp，內含16個外顯子。Chk1具有高度保守的、能催化底物的 N端激酶結構域和200個殘基構成的抑制性的C端調節(jié)結構域（圖1）。其同源物中間區(qū)還接有可變連接域以及作為ATM和ATR激酶的催化底物的SQ/TQ調節(jié)域[1，2]。Chk1通過磷酸化下游分子觸發(fā)多效應細胞反應，包括轉錄調節(jié)、細胞周期停滯或延遲、DNA損傷修復甚至誘導細胞死亡。

1.1 Chk1與細胞周期 ?細胞周期是高度保守、有序進行的細胞增殖過程。人的細胞周期由細胞分裂間期中的G1、S和G2期以及分裂期M期構成。最早證實Chk1能控制G2/M期轉換，是裂殖酵母中CDK1/cdc2的突變體基因[3]。Chk1被阻斷時，紫外線誘導的酵母細胞DNA損傷更易發(fā)生，DNA復制停滯在G2期[4]。隨后在果蠅、人和小鼠中先后發(fā)現(xiàn)了Chk1的同源物，其能調節(jié)細胞分裂的保真度、有絲分裂以及胚胎發(fā)育過程。在非洲爪蟾胚胎中，Chk1以母體/合子基因產物方式瞬時激活，通過靶向cdc25A降解以及SCFβ-TRCP E3泛素連接酶磷酸化降解調節(jié)MBT互質因子Drf1的水平，進而參與中胚軸轉變（MBT）以來延長細胞周期[5，6]。Smith J等[7]通過培育Chk1等位基因純合子的C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)黑色素細胞在胚胎發(fā)育時形成，但在Tyr：Cre表達開始的幾天后逐漸丟失，表明重組后的Chk1蛋白異常消耗導致細胞死亡。Lunardi A等[8]證實ETS轉錄因子家族能直接抑制前列腺癌中Chk 1的轉錄促進腫瘤發(fā)生。研究表明ETS轉化潛力是通過抑制Chk1的表達，進而促進未修復DNA損傷過程激發(fā)的基因組不穩(wěn)定性。進一步研究顯示，磷酸化的Chk1與14-3-3蛋白結合募集到E2F7/8阻遏產物的啟動子區(qū)域干擾轉錄過程，促進ETS家族中非典型E2F表達，進而永久性阻滯S期抑制腫瘤形成[9]。

1.2 Chk1與DDR ?DDR是細胞內和響應DNA損傷的重要調節(jié)信號網絡系統(tǒng)，可協(xié)調、檢測和修復DNA損傷過程。損傷后的DNA一部分能間接通過DDR響應周期活化，另一部分直接修復損傷。若雙鏈DNA斷裂，ATM/ Chk2蛋白激酶通路活化進行修復[10]。而單鏈DNA（ssDNA）的損傷能通過激活ATR/Chk1途徑，磷酸化Ser-317號和Ser-345號位點執(zhí)行DNA損傷檢測途徑[11]。由于Chk1是ATR依賴的DDR反應的關鍵組分，通過組織復制叉塌陷和激活DDR保護細胞免受復制應激的侵害，被認為是腫瘤抑制因子。Lam MH等[12]構建了Chk條件表達小鼠，發(fā)現(xiàn)在單倍體Chk1+/-上皮細胞中，細胞周期異常增殖，S期細胞更早進入有絲分裂過程，表現(xiàn)出惡性腫瘤的征兆。但目前尚未在人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)Chk1完全喪失或突變的純合子，可見作為腫瘤抑制因子Chk1的抑制作用較弱。

2 Chk1 抑制劑

作為DDR的核心，關于靶標Chk1的化療藥物研究不斷深入。起初認為Chk1被抑制時，癌細胞特別是p53缺失的腫瘤細胞會喪失響應和修復DNA損傷的能力，增強放化療法對細胞的殺傷作用。因此，早期Chk1抑制劑集中在與放療或化療結合參與癌癥治療過程。1995年，第一個開發(fā)出的Chk1抑制劑——7-羥基星形孢菌素（UCN-01）進入Ⅰ期臨床試驗。目前已證實其能直接作用于特異性磷酸酶CDC25C和AKT上游的PDK1從而停滯細胞周期[13]。此外，Lien WC等[14]發(fā)現(xiàn)UCN-01能誘導人骨肉瘤U2～OS細胞周期停滯、損傷DNA，并激活非經典下游效應物ERK抑制腫瘤細胞增殖。隨后，不同公司開發(fā)了數(shù)十種小分子Chk1抑制劑，對Chk1具有更高的效力和更高的特異性。

AZD7762是一種有效的Chk1/2的雙重抑制劑，屬于ATP競爭性抑制劑。在人乳腺癌4T1.2細胞中，AZD7762作用后Caspase-3，LC3A/BⅡ，p-eIF2的表達升高而p-Chk1和pChk2的表達降低。證明其能通過誘導自噬和凋亡協(xié)同促進腫瘤細胞增殖[15]。除了抑制作用，Park YH等[16]研究發(fā)現(xiàn)AZD7762能抑制肥大細胞中的Syk及其下游信號蛋白如絲裂原活化蛋白激酶Erk1/2，磷脂酶（PL），Cy1的活化發(fā)揮體外抗過敏作用。MK-8116也叫SCH900776，其屬于高選擇性的Chk1抑制劑，可削弱DNA修復能力主要用于乳腺癌和白血病的治療。與第一代Chk1抑制劑UCN-01相比，其毒性更低，能誘導中心體突變，同時顯著停滯G2/M檢查點，延長有絲分裂期并增加異常分裂細胞數(shù)[17]。LY2603618是一種有效的選擇性Chk1蛋白激酶小分子抑制劑，可用于人非小細胞肺癌、胰腺癌細胞。Laquente B等[18]的65例LY2603618處理的胰腺癌患者的Ⅱ期臨床研究證明，使用LY2603618后胰腺癌患者的總生存期效果不如吉西他濱，若聯(lián)合應用效果可以提高30%。

除了上述常見的Chk1抑制劑，新型的Chk1抑制劑仍然處于臨床開發(fā)階段，目前主要為ATP競爭抑制劑，包括V158411，CCT245737，GDC-0575等。Wayne J等[19]在人類癌癥模型中發(fā)現(xiàn)了V158411作用促進腫瘤細胞作用機制。從分子水平上看，V158411誘導DNA合成過程中γH2AX陽性細胞核呈現(xiàn)時間和濃度依賴性增加。并通過γH2AX表達誘導ATR/ATM/DNA-PKcs DNA損傷應答途徑的激活。CCT245737是臨床開發(fā)的第一個口服活性的候選CHK1抑制劑，現(xiàn)已進入Ⅰ期臨床實驗，其IC50為1.4 nM，對CHK2和CDK1的選擇性>1000倍。CCT245737能抑制多種人腫瘤細胞系中基因毒性誘導的CHK1活性（pS296CHK1）和細胞周期停滯（pY15CDK1）的表達，導致DNA損傷和細胞凋亡增加[20]。GDC-0575為近年來較新型的Chk1抑制劑。Laroche A等[21]發(fā)現(xiàn)GDC-0575消除了DNA損傷誘導的S期和G2/M檢查點，加劇了DNA雙鏈斷裂并誘導軟組織肉瘤STS細胞凋亡。此外，若其與吉西他濱在TP53缺陷的肉瘤模型中聯(lián)合應用可出現(xiàn)協(xié)同或累加效應。Tullio AD等[22]在白血病（AML）中的IC50為1.2 nM，其能阻斷阿糖胞苷（AraC）激活磷酸化的CDK2誘導的Chk1的表達，協(xié)同治療白血病。

3 Chk1抑制抗腫瘤作用機制

眾所周知，多數(shù)傳統(tǒng)抗癌藥物的作用靶標主要為DNA，可通過直接損害DNA或阻礙其前體的合成來消滅腫瘤細胞。在DNA受損過程中，DDR通路活化修補損傷的DNA促使腫瘤細胞繼續(xù)增殖。因此Chk1抑制劑恰好彌補傳統(tǒng)藥物的缺陷，成為抗腫瘤藥物研究熱點。目前已開發(fā)的Chk1抑制劑既可以單獨應用，也能協(xié)同聯(lián)合放療或化療藥物參與臨床抗腫瘤研究，其相關機制也不斷完善。

3.1單一作用 ?起初Chk1抑制劑主要用于治療肺癌、黑色素瘤、膀胱癌等惡性程度較高的腫瘤。其單一作用機制表現(xiàn)為阻滯細胞周期、損傷DNA等。Wayne J等[23]設計并開發(fā)了新型口服Chk1抑制劑VER-250840，體外研究實驗顯示該抑制劑24 h內pChk1抑制率超過90%，并損傷基因組DNA使黑色素瘤A2058細胞出現(xiàn)不可逆性細胞周期停滯。目前，已進入Ⅱ期實驗的Chk1抑制劑prexasertib能通過增加復制應激促進DNA損傷過程，誘導非小細胞肺癌分裂過程提前終止。但卻不可避免的出現(xiàn)化療藥物耐藥性。Deraska P等[24]研究發(fā)現(xiàn)如果敲除FAM122A蛋白，prexasertib的抗性解除，PP2A蛋白表達增加發(fā)揮抗癌活性。此外， CCT244747抑制劑能增加PARP裂解，通過Caspase-3活化誘導膀胱癌T24細胞系和人舌鱗癌Cal27細胞系凋亡[25]。Zhou ZR等[26]首次提出MK-8776作用于人三陰性乳腺癌（TNBC）MDA-MB-231，BT-549和CAL-51細胞后，與單獨照射相比，低劑量的抑制劑能增加放療致敏性并增加3種TNBC細胞中誘導的γH2AX的表達，提示對DNA損傷增強抑制細胞增殖。隨著時間的延長透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn)MK-8776作用后能增強自噬體的數(shù)量促進LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ。在UCN-01處理人結腸癌HCT116等腫瘤細胞后，通過Akt-FoxO3a途徑激活Puma誘導線粒體凋亡途徑。同時期也可觸發(fā)Caspase-9直接激活Caspase-3，進而通過正反饋環(huán)路切割XIAP 發(fā)揮抗腫瘤作用[27]。Wang FZ等[28]研究證實LY2603618后DDR明顯誘導表現(xiàn)為ATM，Chk2，p53和組蛋白H2AX的磷酸化，同時能抑制S296 Chk1和增加DNA損傷介導的S345 Chk1的表達。

3.2聯(lián)合應用 ?除了與放療合用，其他許多化療劑如抗代謝物質或鉑類相關藥物等也參與激活復制應激，引起激活CHK1信號傳導的DNA損傷。因此，CHK1抑制劑已被評估為電離輻射（IR）的敏感劑和多種人類癌癥模型中的細胞毒性藥物。相關課題組通過CHK1抑制劑在體外和體內的生物學評價揭示了它們與放化療等組合的活性以及相關作用機制。

3.2.1增加放療敏感性 ?放射療法（RT）是通過IR造成多種形式的DNA損傷從而殺死惡性腫瘤的常規(guī)治療方式。但經過多次放射后，腫瘤細胞能形成適應性反應進而產生RT抵抗。如今已在多種腫瘤模型中證實Chk1抑制劑能增強放療的敏感性。Zhang Y等[29]報道癌基因c-Myc/CDC25A/c-Src/H-ras/E2F1以及DDR蛋白ATR/CHK1/BRCA1/CtIP在放射抗性乳腺癌細胞（RBCC）中表達上升。Chk1抑制劑AZD7762治療后，DNA消耗增加，復制叉進展速度顯著降低，同時中斷復制叉穩(wěn)定性與同源重組過程，增加放射敏感性。此外，不同的Chk1抑制劑暴露在IR后對細胞毒性的作用機制不同。Suzuki M等[30]發(fā)現(xiàn)新型選擇性抑制劑MK-8776不同于傳統(tǒng)抑制劑UCN-01影響DNA雙鏈的作用機制，而是通過激活紡錘體組裝檢查點增加有絲分裂缺陷。

3.2.2協(xié)同其他化療藥物 ?相較于Chk1抑制劑的單一作用，關于Chk1抑制劑與其他分子靶向劑協(xié)同抗腫瘤的研究更為深入。目前已發(fā)現(xiàn)Chk1抑制劑可與抗代謝藥物、鉑類化療藥物以及其他靶向抑制劑如PAPP抑制劑等結合。并進一步研究揭示相關組合的效應機制，彌補單一抗癌藥物缺陷。吉西他濱隸屬嘧啶類抗腫瘤藥，主要通過阻斷核酸的合成（S期）治療肺癌、乳腺癌等疾病。Barnard D等[31]發(fā)現(xiàn)單獨使用吉西他濱誘導腫瘤細胞Chk1磷酸化，副作用較大。當兩者聯(lián)合治療后，LY2603618能加強阻斷S期檢查點聯(lián)合誘導腸癌、肺癌和胰腺癌異種移植模型腫瘤的生長。Vincelette ND等[32]報道在急性髓系白血病（AML）U937細胞中，Chk1抑制劑MK-8876能降低CPX-351誘導的Chk1 Ser-296號、KAP 1 Ser-473號以及CDC25A磷酸化水平，自動降解復制檢查點蛋白，并誘導細胞凋亡進而增強對原發(fā)性AML的抗增殖作用。此外，SB218078抑制劑與奎納克林不僅能阻斷G2/M期促進有絲分裂過程中斷，還能通過破壞乳腺癌細胞BER通路進而誘導細胞凋亡[33]。

此外，將Chk1抑制劑與靶向DDR位點藥物結合的研究引起廣泛關注。主要包括WEE1抑制劑、PAPP抑制劑等方面。Hauge S等[34]研究發(fā)現(xiàn)單獨使用WEE1抑制劑MK1775能使S期CDK活性增加，聯(lián)合給與Chk1抑制劑負向調控復制因子Treslin表達，抑制CDC45負荷，從而限制S期DNA損傷程度，起到協(xié)同抗癌的作用。Booth L等[35]報道顯示Chk1抑制劑SRA737與PARP抑制劑niraparib聯(lián)合后自噬相關底物p62和LAMP62水平降低，同時ATG5、p-ATG13以及Beclin1表達增加。兩者協(xié)同經mTOR-AMPK-ULK途徑發(fā)揮殺傷性自噬作用，或經Bcl-XL內在凋亡通路抑制腫瘤增長。另有研究顯示，LY606368與PARP1抑制劑BMN673協(xié)同促進胃癌經Caspase經典途徑凋亡，并抑制同源重組修復加速細胞死亡[36]。

4總結

開發(fā)越來越有效和特異性的Chk1抑制劑在臨床實驗中逐漸受到重視。Chk1是癌癥對常規(guī)治療的選擇性致敏的良好靶標。本文總結了Chk1的功能效應及其在腫瘤中的作用機制，在此基礎上，進一步分析Chk1抑制劑的進展與腫瘤關系的作用機制?？傊?，了解Chk1及其抑制劑與腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制有助于構建新一代Chk1抑制劑彌補現(xiàn)今腫瘤治療的缺陷。最后，想要產生新型的Chk1抑制劑，還要在臨床試驗中獲得成功測試，不斷尋找優(yōu)化的方案以提高其功效，并鑒定適合這些藥劑的生物標志物等，從而在正在進行的以及未來的臨床試驗中完全闡明Chk1抑制劑在癌癥治療中的作用。

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