勿色桿菌和假單胞菌對原油降解特征對比＊

徐榮德 萬云洋，3 陳踐發(fā) 王曉梅 蘇 勁

(1.中國石油大學(xué)(北京)地球科學(xué)學(xué)院；2.油氣資源與探測國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.油氣污染防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.中國石油勘探開發(fā)研究院)

0 引 言

在原油的開采、儲運(yùn)過程中，油品的泄漏通常會造成土壤污染，石油烴類污染已成為石油石化行業(yè)土壤污染的主要形式之一。在眾多石油烴污染土壤的修復(fù)方法中，微生物修復(fù)法具有高效率低成本、無二次污染、應(yīng)用范圍廣泛及不破壞生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已成為土壤修復(fù)的主流技術(shù)之一[1-2]。

已報(bào)道原油降解菌共約100余屬200多種，尚缺針對革蘭氏陰性菌(G-)和革蘭氏陽性菌(G+)石油烴降解的系統(tǒng)對比研究。其中G-假單胞菌屬(Pseudomonas)和G+勿色桿菌屬(Achromobacter)[3]均為較常見的原油降解菌[4-6]。以往的部分報(bào)道認(rèn)為，假單胞菌屬對原油降解效率更高[7-8]，且對苯、萘及熒蒽等高分子量多環(huán)芳烴有較強(qiáng)的降解能力[9-11]，而勿色桿菌屬對原油的降解效率相對偏弱，但有較寬的烷烴降解譜[12]。

本文通過從勝利油田油污土壤中分離篩培出的純菌黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)和勿色桿屬菌種(Achromobatersp)在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬土壤環(huán)境中原油微生物降解。首次分析原油降解氣組分變化特征并結(jié)合降解油族組分及飽和烴生物標(biāo)記化合物特征，對比分析G+和G-的降解特征，為原油烴類污染土壤的微生物修復(fù)提供理論依據(jù)與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 原油樣品及菌種來源

原油樣品取自塔里木油田TH13-C井未遭受生物降解的海相原油，飽和烴組分含量約為69%，芳烴含量25.8%。菌種來自勝利油田現(xiàn)場油浸土壤，以原油為唯一碳源，經(jīng)富集和選擇性培養(yǎng)獲得的原油降解菌。降解菌經(jīng)分離獲得兩株純菌，經(jīng)鑒定分別為革蘭氏陽性勿色桿屬菌種(Achromobatersp) SLTHX114株和典型原油降解耗氧革蘭氏陰性黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214株。培養(yǎng)基配置及菌種富集如下[13]：

1)配制液體培養(yǎng)基。取酵母膏0.5 g、胰朊胨1.0 g、NaCl 0.5 g置于200 mL錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水配得液體培養(yǎng)基。平均分配到兩個(gè)100 mL錐形瓶中后封口并高溫高壓滅菌30 min左右。

2)石油降解菌搖菌。待培養(yǎng)基滅菌完畢冷卻至室溫，然后分別向兩個(gè)錐形瓶中接入SLTHX114株和SLTHX214株兩種石油降解菌。使菌濃達(dá)到109個(gè)/mL，于4℃下保存。

1.2 原油生物降解模擬實(shí)驗(yàn)

將油氣運(yùn)聚地球化學(xué)示蹤物理模擬子系統(tǒng)的管線轉(zhuǎn)換成并聯(lián)模式，清洗高壓管并干燥，微生物降解模擬實(shí)驗(yàn)示意見圖1。用蒸餾水將已經(jīng)過酸堿處理過的石英砂反復(fù)沖洗后置于馬弗爐內(nèi)干燥。取適量石英砂和40 mL原油充分?jǐn)嚢杌旌虾笃骄b于4個(gè)高壓管中并編號M1、M2、M3和M4號。向M1和M2號高壓管中各加入20 mL石油降解菌SLTHX114株，向M3和M4號高壓管中各加入20 mL石油降解菌SLTHX214株。最后在M1號和M3號高壓管中各加入20 mL微生物營養(yǎng)液[14]。密封高壓管，常壓、溫度調(diào)節(jié)至40℃。每隔1周通空氣并在第4周和第8周分別收集原油降解氣及中間降解原油樣品，對氣體組分、油樣族組分、飽和烴色質(zhì)進(jìn)行定量分析。同時(shí)設(shè)置M0作為空白對照樣。接種SLTHX114株并加入營養(yǎng)液的高壓管發(fā)生泄漏導(dǎo)致M2號實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無效。

圖1 微生物降解模擬實(shí)驗(yàn)示意

1.3 GC-MS、GC-FID分析

氣體組分分析使用美國Vasson公司的US10917013-7890A型微量氣相色譜儀，每次進(jìn)樣2 mL。檢測條件：進(jìn)樣溫度為200℃，檢測器(FID)溫度310℃，氣體分析溫度為50℃，運(yùn)行時(shí)間20 min；以氦氣為載氣，流速1 mL/min[15]。

降解的油水混合物進(jìn)行油水分離，用正己烷沉淀瀝青質(zhì)，然后用硅膠-氧化鋁柱色層分離出飽和烴、芳烴和非烴。

飽和烴色質(zhì)分析用TRACE GC ULTRA色譜儀，連接Thermo DSQII質(zhì)譜儀，使用30 m長、HP-5型、直徑0.25 mm、膜厚0.25μm的毛細(xì)管柱。He作為載氣，1 cm3/min恒流。程序升溫：50℃恒溫5 min；50～220℃，4℃/min；220～320℃，2.0℃/min；320℃恒溫25 min，氣化室溫度300℃。

2 結(jié)果與討論

對空白對照樣M0接種SLTHX114株的M1、接種SLTHX214株，并加入微生物營養(yǎng)液的M3以及接種SLTHX214株的M4模擬樣品進(jìn)行第4周降解氣組分、第4周及第8周原油族組分以及相關(guān)生標(biāo)化合物變化特征分析。

2.1 降解氣組分變化特征

微生物在對原油降解過程中常伴隨著CO2的產(chǎn)生[16]。本模擬實(shí)驗(yàn)中，隨著降解時(shí)間的增加，第4周取得模擬氣樣組分特征如圖2所示。接種兩種原油降解菌SLTHX114株和SLTHX214株的模擬實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的降解氣CO2含量均較高(18.26%～90.51%)。對比兩種原油降解菌模擬實(shí)驗(yàn)降解氣組分差異，發(fā)現(xiàn)接種SLTHX214株的M3和M4降解氣中CO2表現(xiàn)出高異常現(xiàn)象(分別為87.36%和90.51%)，而烴類組分相對較低。而接種SLTHX114株的M1中CO2含量(18.26%)遠(yuǎn)低于接種SLTHX214株的氣樣，而烴類組分(C2～C5)含量相對較高，表明菌株SLTHX214對原油的降解能力相對更強(qiáng)。

注：M1為接種勿色桿菌并加入微生物營養(yǎng)液；M3為接種黃色假單胞菌并加入微生物營養(yǎng)液；M4為接種黃色假單胞菌；M0為空白對照樣。圖2 兩種原油降解菌模擬實(shí)驗(yàn)降解氣組分對比

2.2 原油族組分變化特征

微生物降解原油各組分的難易程度一般為：飽和烴>芳烴>膠質(zhì)和瀝青質(zhì)，其中芳烴具有數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)獨(dú)特、機(jī)理復(fù)雜等特征[17-18]，且其溶解性強(qiáng)，遷移能力高，會對土壤及地下水造成較大危害[19]。

通過模擬實(shí)驗(yàn)第4周和第8周降解原油與原始油樣族組分對比分析見圖3，降解原油中芳烴組分明顯降低，飽和烴、非烴和瀝青質(zhì)含量相對增加，其中飽和烴含量變化較非烴和瀝青質(zhì)小，表明兩種原油降解菌對原油中飽和烴和芳烴均有降解，但芳烴組分降解具有相對優(yōu)勢。對比兩種降解菌在模擬第4周降解原油的族組分含量差異，M3和M4樣品中芳烴組分含量(分別為17.8%和13.8%)低于M1(20.3%)，而飽和烴含量較高，表明菌株SLTHX214對芳烴的降解強(qiáng)度和速率可能高于菌株SLTHX114，體現(xiàn)出不同菌株對原油的降解作用具有速度效應(yīng)。隨著降解時(shí)間的增加，第8周測得的3個(gè)模擬油樣的各族組分含量趨于穩(wěn)定，菌株SLTHX114對原油的降解程度達(dá)到與菌株SLTHX214相同的效果。對比不同降解時(shí)間M3和M4原油族組分的變化特征，第4周M4樣品中芳烴組分含量明顯低于M3，至第8周兩者各組分趨于相同，表明營養(yǎng)液對微生物降解原油啟動有協(xié)助作用，隨著降解時(shí)間的增加，降解速率趨于穩(wěn)定。

注：M0為原始油樣；M1為接種勿色桿菌加入微生物營養(yǎng)液；M3為接種黃色假單胞菌并加入微生物營養(yǎng)液；M4為接種黃色假單胞菌；M1-2、M3-2和M4-2為降解第8周原油。圖3 兩種原油降解菌模擬實(shí)驗(yàn)第4周和第8周降解油族組分對比

2.3 生物標(biāo)志化合物評價(jià)原油降解程度

生物標(biāo)志化合物是原油中相對較難被微生物降解的一類化合物，因不同化合物對微生物降解的敏感性存在差異，因此常被用來評價(jià)原油微生物降解程度。本文對飽和烴主要生物標(biāo)志物——正構(gòu)烷烴、類異戊二烯烴和萜類化合物進(jìn)行了對比分析。

通過對原始油樣及生物降解原油的生物標(biāo)志化合物參數(shù)對比見表1，接種兩種菌株的降解原油生標(biāo)參數(shù)Pr/nC17、Ph/nC18和(Pr+Ph)/(nC17+nC18)較原始樣品明顯增大，表明正構(gòu)烷烴已被微生物降解至一定閾值，并開始與類異戊二烯烴同時(shí)被消耗。降解原油中Pr/Ph比值遠(yuǎn)小于未降解油，表明姥鮫烷對生物降解作用較植烷更敏感，降解速率更大，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。兩種菌株對原油降解的不同階段，上述參數(shù)均未表現(xiàn)出明顯差異。但通過比值參數(shù)C30αβH/(Pr+Ph)變化特征來看，隨著降解時(shí)間增大，該參數(shù)表現(xiàn)出顯著增大的特征，且在兩種菌株之間也表現(xiàn)出較大的差異。接種菌株SLTHX114的降解油樣該參數(shù)在降解不同階段均相應(yīng)的高于接種菌株SLTHX214的降解油樣，表明菌株SLTHX114對飽和烴降解更具優(yōu)勢，且兩種菌株對原油的降解等級已達(dá)到4級降解。

表1 不同原油降解菌不同時(shí)間降解原油中主要生物標(biāo)志參數(shù)對比

另外，與前人研究成果相反的是，兩種菌株降解原油的伽馬蠟烷指數(shù)及Ts/Tm參數(shù)隨生物降解而表現(xiàn)出降低的趨勢。因此，在嚴(yán)重生物降解原油油源對比，沉積環(huán)境分析及成熟度評價(jià)時(shí)，上述參數(shù)均不可用。

3 結(jié) 論

綜上所述，革蘭氏陰性的黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214對原油的降解能力和效率強(qiáng)于革蘭氏陽性的勿色桿屬菌種(Achromobatersp)SLTHX114。兩種原油降解菌均優(yōu)先降解原油中芳烴組分，黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214對芳烴的降解能力相對高于勿色桿屬菌種(Achromobatersp)SLTHX114，而勿色桿屬菌種(Achromobatersp)SLTHX114對原油中飽和烴組分的降解能力相對強(qiáng)于黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)SLTHX214，不同菌種對原油不同組分具有選擇性和互補(bǔ)性。自然生態(tài)環(huán)境中，G+和G-不是單獨(dú)存在的，其合理菌群的構(gòu)建，可為原油烴類污染土壤的微生物修復(fù)提供理論依據(jù)與技術(shù)參考。對上述兩種原油降解菌的降解機(jī)理和土壤降解效率還在進(jìn)一步研究中。