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    超聲波輔助酶法提取沙棘果油及其體外抗氧化能力分析

    2019-11-15 06:36:04蔡永國歐陽韶楊海燕
    中國糧油學(xué)報 2019年10期
    關(guān)鍵詞:果油油率原漿

    劉 儉 蔡永國 張 兵 歐陽韶 楊海燕,3

    (新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院1,烏魯木齊 830052) (新疆慧華沙棘生物科技有限公司2,阿勒泰 836200) (新疆沙棘工程技術(shù)研究中心3,烏魯木齊 830000)

    沙棘(HippopherhamnoidsL.)為胡頹子科沙棘屬灌木,又名醋柳、黑刺等[1],廣泛分布于歐亞的溫帶地區(qū)[2]。我國沙棘資源豐富,總面積達3000萬畝[3],占世界沙棘總面積的95%,且以肋果沙棘和中國沙棘亞種分布居多[4]。沙棘鮮果富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、黃酮類化合物及不飽和脂肪酸等[5],沙棘果油(本研究僅指鮮果果油)是沙棘果實天然生物活性成分的精華,具有抗輻射、抗衰老、抗?jié)?、降血脂和增強免疫力等藥理功效[6],被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域[7]。

    目前直接從沙棘鮮果中提取沙棘果油的方法主要有酶法[8]、壓榨離心法[9]和有機溶劑萃取法[10]等。與傳統(tǒng)提油工藝相比,酶法提油條件溫和,能夠最大限度保留活性成分,且其所需設(shè)備簡單,滿足食用油脂生產(chǎn)“安全、高效、營養(yǎng)、綠色”的原則[11]。UAE提取技術(shù)在近年來發(fā)展迅速,張妍[12]等提取菜籽油,發(fā)現(xiàn)UAE提取油脂得率可達67.55%,明顯優(yōu)于單一酶法提取。超聲波在液體中可以產(chǎn)生機械效應(yīng)、空化作用以及熱效應(yīng)等[13],破壞細(xì)胞壁,進而暴露更多的酶促位點[14],與酶法結(jié)合進行酶解反應(yīng),能夠極大地縮短酶法提取時間和提高產(chǎn)品得率。有關(guān)UAE提油的研究較多,張偉光[15]等采用超聲波輔助蛋白酶法提取冬瓜籽油,在最優(yōu)條件下冬瓜籽油的提取率可達82.55%,比優(yōu)化前高10.06%;徐君飛等[16]從茶葉籽中提油,發(fā)現(xiàn)UAE提取工藝在最佳條件下,茶葉籽出油率為(52.61±0.11)%。

    顧晶晶[17]采用超聲波預(yù)處理沙棘原漿,超聲功率200 W、超聲時間10 min,然后加入酶制劑進行酶解提油,發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理對酶法提取沙棘果油沒有幫助。然而關(guān)于UAE提取沙棘果油鮮有報道,本研究基于此出發(fā)點以沙棘鮮果為原料,采用UAE提取沙棘果油。首先在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶制劑的比例,然后利用單因素與正交試驗對沙棘果油的提取工藝進行優(yōu)化,旨在降低沙棘果油的提取成本和提高果油得率;同時運用GC對沙棘果油的脂肪酸組成進行分析,并測定沙棘果油的體外抗氧化能力,以期為UAE提取高品質(zhì)的沙棘果油的工業(yè)化提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 材料與試劑

    沙棘鮮果:2017年10月采摘于新疆青河縣,-18 ℃低溫凍存至6月份實驗;果膠酶:最適pH 3.5~4.0,最適溫度50 ℃,酶活力500 U/mg;纖維素酶:pH 4.8~5.0,50 ℃,酶活力≥50 U/mg;酸性蛋白酶:pH 2.5~4.0,40~50 ℃,酶活力≥50 U/mg。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    TC-1056破壁養(yǎng)生調(diào)理專家;TDL-5-A低速大容量離心機;5417R小型臺式冷凍型離心機;KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器;SZF-06A脂肪測定儀;GC-2014氣相色譜儀;UV-1200紫外可見分光光度計。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 沙棘果油提取工藝流程

    沙棘凍果→解凍(水溫60 ℃、時間1 min)→打漿過濾→沙棘原漿→調(diào)節(jié)pH→超聲酶解→離心分離(4 000 r/min離心20 min)→上層果油粗品→二次離心(8 000 r/min離心10 min )→沙棘果油

    1.2.2 沙棘原漿基本指標(biāo)的測定

    水分的測定:GB 5009.3—2016直接干燥法;可溶性固形物:使用PAL-1數(shù)字手持袖珍折射儀進行測定,結(jié)果以°Brix計;pH:使用PHS-3C PH計進行測定;粗脂肪的測定:GB 5009.6—2016索氏抽提法;粗蛋白的測定:GB 5009.5—2016凱氏定氮法;總酸:GB/T 12456—2008酸堿滴定法,結(jié)果以蘋果酸計(沙棘原漿主要的有機酸之一[18])。

    1.2.3 沙棘果油得油率計算

    沙棘果油得油率和提取率的計算公式:

    (1)

    式中:m為果油質(zhì)量/g;M為沙棘原漿的質(zhì)量/g。

    (2)

    式中:W為沙棘原漿粗脂肪含量。

    1.2.4 復(fù)合酶制劑比例的篩選

    1.2.4.1 單一酶添加量的單因素試驗

    選擇果膠酶、纖維素酶、酸性蛋白酶添加量進行單因素試驗,固定酶解時間4 h、超聲功率150 W,考察三種酶在其最適酶解環(huán)境下,添加量梯度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)%對沙棘果油得油率的影響。

    1.2.4.2 復(fù)合酶制劑比例的優(yōu)化試驗

    根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,設(shè)置酶解的條件為:超聲功率150 W、酶解時間4 h、酶解溫度50 ℃和pH 4.0。選取果膠酶添加量(A),纖維素酶添加量(B),酸性蛋白酶添加量(C)作為試驗因素,以沙棘果油得油率(Y)為響應(yīng)值,采用Design-Expert 10.0.3軟件,根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理,優(yōu)化復(fù)合酶制劑比例,試驗因素與水平見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗的因素與水平

    1.2.5 提取工藝的優(yōu)化

    1.2.5.1 單因素試驗

    采用單因素試驗,考察不同的超聲功率(100、125、150、175、200)W、超聲酶解時間(2、3、4、5、6)h、pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)和復(fù)合酶總添加量(0.6、0.9、1.2、1.5、1.8)%對沙棘果油得油率的影響。

    1.2.5.2 正交優(yōu)化試驗

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取超聲功率、超聲酶解時間、pH和復(fù)合酶總添加量一共4個因素,按照L9(34)的正交表進行正交試驗。探究UAE提取沙棘果油工藝優(yōu)化的參數(shù)。

    表2 正交試驗的因素與水平

    1.2.6 GC分析沙棘果油脂肪酸組成

    根據(jù)GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》中第三法歸一化法進行測定[19]。

    1.2.7 沙棘果油活性成分的測定

    黃酮:參照Sharif等[20]方法進行測定;維生素E:參照Cenkowski等[21]的方法進行測定;類胡蘿卜素:參照楊萬政等[22]的方法進行測定。

    1.2.8 沙棘果油體外抗氧化能力的測定

    ·OH清除能力的測定:參照Hifney等[23]的方法進行測定。ABTS+·清除能力的測定:參照Li等[24]的方法進行測定。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析使用Excel和SPSS 21.0軟件,作圖采用Origin 8.5軟件,使用Design-Expert 10.0.3軟件進行Box-Behnken響應(yīng)面分析和Taguchi OA試驗設(shè)計。

    2 結(jié)果與分

    2.1 沙棘原漿的主要成分

    對制得的沙棘原漿立即進行理化指標(biāo)的測定,其測定結(jié)果見表3。

    表3 沙棘原漿的主要成分

    2.2 復(fù)合酶制劑比例的確定

    2.2.1 單一酶添加量的單因素試驗結(jié)果

    圖1 單一酶添加量對沙棘果油得油率的影響

    2.2.2 復(fù)合酶制劑比例的優(yōu)化試驗結(jié)果

    基于單因素試驗,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化復(fù)合酶制劑的比例,進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗。具體試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

    表4 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

    表5 Box-Behnken試驗結(jié)果二次回歸方差分析

    注:P<0.01,極顯著(**);P<0.05,顯著(*)。

    2.3 UAE提取工藝的優(yōu)化

    2.3.1 單因素試驗結(jié)果

    圖2 不同因素對沙棘果油得油率的影響

    由圖2可知,在酶法提取沙棘果油的過程中施加超聲波,當(dāng)超聲功率為100~125 W時,得油率不斷升高,在超聲功率125 W時達到最高。這是因為超聲波的機械振動和空化作用能夠破壞細(xì)胞組織,促進胞內(nèi)物質(zhì)的釋放,酶解與之結(jié)合能夠大大提高果油得率[27]。當(dāng)超聲功率大于125 W時,沙棘果油得率開始下降;當(dāng)超聲功率在200 W時,甚至低于對照組(0 W),這與較高的超聲功率導(dǎo)致酶活降低或部分喪失有關(guān)[28]。隨著超聲酶解時間的延長,沙棘果油得率不斷提高,在超聲酶解時間2~3 h時,得油率上升幅度較大,當(dāng)時間超過3 h后,得油率基本保持不變。這是由于酶解效率隨著時間的延長逐漸提高,油脂釋放就會越多,但是繼續(xù)延長時間,酶解反應(yīng)會因為底物減少以及產(chǎn)物增多而受到抑制。隨著pH升高,沙棘果油得油率先增加后減小,當(dāng)pH為3.5時,得油率最高為3.424%。這是因為酶不在最適pH條件下,其活性會受到抑制,導(dǎo)致得油率下降。當(dāng)復(fù)合酶總添加量為0.6~1.2%時,沙棘果油得率隨著酶添加量的增多不斷升高,繼續(xù)增加復(fù)合酶總添加量,得油率變化不大。

    2.3.2 工藝的優(yōu)化試驗結(jié)果

    由表6可知,正交試驗結(jié)果最優(yōu)組合為2號(X1-1X2-2X3-2X4-2),得油率為3.465%,各因素對沙棘果油得油率的影響主次順序為X4(復(fù)合酶添加量)>X1(超聲功率)>X3(pH)>X2(超聲酶解時間),最優(yōu)工藝的水平組合為X1-2X2-2X3-2X4-2。對其進行驗證試驗,沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%,優(yōu)于正交試驗2號。因此選擇X1-2X2-2X3-2X4-2作為UAE提取沙棘果油的最佳工藝,即超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復(fù)合酶添加量1.2%,超聲酶解溫度50 ℃,在此工藝下的沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%,提取率為83.9%。

    表6 正交試驗結(jié)果

    2.4 沙棘果油的脂肪酸組成及其活性成分分析

    2.4.1 脂肪酸組成分析

    據(jù)查國立北平師范大學(xué)始建于1902年京師大學(xué)堂(師范館),后經(jīng)多次大學(xué)演變于1931年7月北平師范大學(xué)與北平女子師范大學(xué)合并,定名國立北平師范大學(xué)。1932年經(jīng)教育部正式批準(zhǔn)改為國立北平師范大學(xué)。1937年7月,盧溝橋事變后,北平師范大學(xué)遷往西安,與國立北平大學(xué)、國立北洋工學(xué)院組成西安臨時大學(xué)。1938年春,西安臨時大學(xué)遷至漢中,改名為國立西北聯(lián)合大學(xué),北平師大改為西北聯(lián)大教育學(xué)院。同年8月,西北聯(lián)合大學(xué)教育學(xué)院改為師范學(xué)院,后改稱國立西北師范學(xué)院。

    采用GC分析UAE提取的沙棘果油脂肪酸組成,由表7可知,沙棘果油的脂肪酸被檢測出13種,主要脂肪酸為棕櫚酸、棕櫚油酸和亞油酸。不飽和脂肪酸共有6種,含量高達60.596 1%,分別為棕櫚油酸、順-10-十七碳一烯酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸和神經(jīng)酸,其中棕櫚油酸含量達到43.389 9%,亞油酸含量為11.266 5%。棕櫚油酸具有降低血脂,預(yù)防動脈硬化和緩解糖尿病、脂肪肝等慢性疾病的功效[29];亞油酸是人體必需脂肪酸,具有增強機體免疫能力,防治動脈粥樣硬化和老年性肥胖癥等功效[30],由此可知沙棘果油具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。

    表7 沙棘果油的脂肪酸組成與相對含量

    2.4.2 活性成分分析

    表8可見,采用UAE提取的沙棘果油含大量活性成分,其黃酮含量為(62.88±0.26) mg/100 g,維生素E含量為(150.35±0.08) mg/100 g,類胡蘿卜素含量為(14.66±0.32) mg/100 g。

    表8 沙棘果油的活性成分

    2.5 沙棘果油體外抗氧化能力研究

    2.5.1 沙棘果油清除·OH能力

    圖3 對·OH的清除率

    羥自由基廣泛存在于生物體內(nèi),是一種細(xì)胞毒性很強的自由基,能使胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)出現(xiàn)損傷,從而引發(fā)各種疾病和機體衰老,且其反應(yīng)極快[31]。由圖3可知,隨著質(zhì)量濃度的增大,沙棘果油和VC清除·OH的能力幾乎呈線性上升,其清除·OH的IC50分別為179.33 μg/mL和122.62 μg/mL,VC的·OH清除能力是沙棘果油的1.46倍。結(jié)果表明,沙棘果油清除·OH的能力較強,略弱于VC。

    2.5.2 沙棘果油清除ABTS+·能力

    由圖4可知,在質(zhì)量濃度為4~12 mg/mL時,沙棘果油的ABTS+·清除能力呈現(xiàn)線性上升的趨勢,由41.26%~95.25%,之后趨于平緩。VC對ABTS+·的清除能力基本維持在99%左右,表明質(zhì)量濃度為12 mg/mL的沙棘果油與VC的ABTS+·清除能力相近。沙棘果油對ABTS+·清除作用的IC50=5.54 mg/mL。

    圖4 對ABTS+·的清除率

    3 討論

    通過測定UAE提取的沙棘果油脂肪酸組成、活性成分及其體外抗氧化能力,結(jié)果證明沙棘果油富含不飽和脂肪酸,是一種營養(yǎng)價值極高的植物油脂,同時具有較強的抗氧化能力。目前直接從沙棘鮮果中提取沙棘果油的方法主要有酶法、壓榨離心法和有機溶劑萃取法等。李煒等[9]采用壓榨離心法提取沙棘果油,溫度60 ℃、8 000 r/min離心10 min,工藝簡單但是得油率不足1%,提取率為35.6%。采用UAE提取沙棘果油,超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復(fù)合酶添加量1.2%,超聲酶解溫度50 ℃,在該條件下的沙棘果油得油率可達3.5%,提取率為83.9%。沙棘果實的細(xì)胞壁主要由果膠、纖維素和半纖維素等物質(zhì)組成[32],沙棘果油在果實兩端和細(xì)胞質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中,以脂蛋白、脂多糖等形式存在[33]。選擇果膠酶、纖維素酶和酸性蛋白酶復(fù)配,能使細(xì)胞壁與胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)酶解更加徹底,提高沙棘果油的得油率。酶法提油反應(yīng)條件溫和,結(jié)合超聲波輔助處理可以大大減少酶解時間,本實驗中,超聲酶解時間3 h,較康健等[32]縮短50%,較汪曉琳[34]縮短29.2%,最大限度地保持了沙棘原漿風(fēng)味和保留沙棘天然活性成分。沙棘原漿經(jīng)UAE提取沙棘果油后,采用液體超微化粉粹、超高壓均質(zhì)勻漿、脫氣和殺菌灌裝將果漿加工成沙棘濁汁[35],此種方法能夠增加單位原料價值,為企業(yè)經(jīng)濟效益的提高提供了技術(shù)支撐。

    4 結(jié)論

    采用單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗對復(fù)合酶的比例進行優(yōu)化,得到最優(yōu)添加量比例為果膠酶∶纖維素酶∶酸性蛋白酶=0.675%∶0.424%∶0.508%。通過單因素與正交試驗對沙棘果油的UAE提取工藝進行優(yōu)化,獲得最優(yōu)的工藝為超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復(fù)合酶添加量1.2%,超聲酶解溫度50 ℃,該條件下沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%,提取率為83.9%。運用GC對沙棘果油的脂肪酸組成進行分析,沙棘果油的脂肪酸被檢測出13種,主要為棕櫚酸、棕櫚油酸和亞油酸。不飽和脂肪酸共有6種,含量高達60.596 1%,分別為棕櫚油酸、順-10-十七碳一烯酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸和神經(jīng)酸,其中棕櫚油酸含量達到43.389 9%,亞油酸含量為11.266 5%。沙棘果油的黃酮含量為(62.88±0.26)mg/100 g,維生素E含量為(150.35±0.08)mg/100 g,類胡蘿卜素含量為(14.66±0.32) mg/100 g。同時,體外抗氧化能力的測定結(jié)果表明沙棘果油具有較強的體外抗氧化能力。

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